人骨髓不连续密度梯度离心用于间充质干细胞生产

试剂和材料：
1.完全培养基：α-MEM：α-低限量基础培养基，含谷氨酰胺，无核苷酸或脱氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经F杂交瘤纯化，非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。过滤除菌。储存于4℃，不超过2周；
2.无钙或镁的磷酸盐缓冲液；
3.无钙或镁的Hankrime平衡盐溶液；
4.Ficoll-Paque淋巴细胞分离液；
5.聚丙烯离心管，15ml和50ml；
6.塑料组织培养皿，直径15cm；
7.塑料微量移液器枪头，10μl；
8.0.85%台盼蓝盐溶液；
9.微量离心管；
10.带吊桶式转头的低温台式离心机

实验方法：
1.去除抗凝管盖子，将骨髓液转移至50ml离心管中。加入室温的H，确保体积达到25ml；
2.取另一个50ml离心管，加入20ml Ficoll-Paque淋巴细胞分离液，将25ml细胞悬液轻轻加到Ficoll上层。H与Ficoll间的界面不能被破坏；
3.关闭闸，室温1800g离心30min；
4.离心完毕，于Ficoll和H的界面收集白色细胞层，将其移至新的50ml离心管中；
5.用H将收集到的细胞悬液体积调整至3倍，室温1000g离心10min。重复洗涤；
6.用30ml预热至37℃的CMM重悬细胞；
7.取10μl细胞悬液加到10μl台盼蓝中，血细胞计数器评价细胞的存活率，存活率需高于80%；
8.将30ml细胞悬液移至直径15cm组织培养皿中，于5%CO2培养箱中培养至少15h；
9.从培养箱中取出培养皿，吸出培养基；
10.加入20ml预热的A，润洗单层细胞，弃去；
11.重复润洗过程3次；
12.加入30ml预热的新鲜CMM；
13.每隔一天重复此润洗和更新培养基操作，共6天；
14.6天后，在倒置显微镜下观察单层细胞，贴壁的、成纤维细胞样MSCs克隆在培养皿中清晰可见。有时可能有造血细胞污染的迹象，但这些细胞可以在传代时被去除。培养物达到50%—60%汇合时，可以进行MSCs培养物的扩增和冻存；