建议尝试对样本中包含的有核细胞的数量做一个评估(有核细胞的最佳浓度是1×106个细胞/ml.培养液)
一、培養製備
1: 在室温或37±2℃的温度下解冻骨髓细胞染色体同步化套装培养管或培养瓶。
2: 在无菌条件下添加1ml骨髓(加入的量由样本细胞密度决定)至一个试管中或分配5ml瓶装的介质到一个细胞培养瓶中并加入样本。
3: 盖上培养管的盖子。
4: 混合培养管(或培养瓶)中的物质,水平放置(在它的平坦的表面上),并在37±2℃的温度下温育。没有必要添加CO2, 因为该介质的构成就是为关闭系统中最佳的淋巴细胞扩散而设计的。
二、培養同步化
1: 经过48-72小时的培养后,添加0.1ml的溶液A并温育一整夜。
2: 温育后,添加0.1ml的溶液B并温育5小时(没有必要清洗细胞)。
3: 添加20ul秋水仙素(10ug/ml),并在37±2℃的温度下温育60分钟(大约)。如果要获得更多数量的前中期分裂相,可将温育时间减少至15分钟。
三、染色體固定和玻片製備
1: 温育后,如有必要,将培养转移至一个试管,并用离心机分离3-4分钟,转速为每分钟2.000(更快的转速不会损坏细胞)。
2: 倒掉上层清液,注意不要使细胞粒子松散(推荐留大约0.5ml的物质在试管内)。
3: 有力地重新悬挂粒子。
4: 添加5ml低渗液(滴入H2O、0.56%氯化钾),并充分混合。
5: 在室温下至少温育7分钟。
6: 用离心机分离3-4分钟,转速为每分钟2.000。
7: 根据步骤2倒掉上层清液。
8: 有力地重新悬挂粒子。
9: 添加5ml Ibraimov溶液(滴入H2O、5%醋酸),并充分混合。
10: 立即用离心机分离3-4分钟,转速为每分钟2.000。
11: 根据步骤2倒掉上层清液。
12: 有力地重新悬挂粒子。
13: 添加5ml固定液(甲醇:醋酸,3:1),并充分混合。
14: 重复步骤10-13。
15: 立即用离心机分离3-4分钟,转速为每分钟2.000。
16: 仔细倒掉几乎全部的上层清液。
17: 添加几滴新准备的固定剂,要考虑到滴数应当适合粒子内的细胞浓度。
18: 滴一小滴细胞悬浮液到一块干净且湿润的显微镜玻片上。
19: 放进Optichrome染色体分散仪(貨號: EKAMH950)内,在正确温度和相对湿度的恒定条件下蒸发。