影响 PCR 反应的主要因素（除 Mg²⁺外）

一、引物相关因素

• 引物长度、GC 含量、Tm 值
• 引物二聚体、发夹结构
• 引物浓度（过高易二聚体，过低扩增弱）
• 引物特异性（是否与非目标区域同源）

二、模板 DNA 相关因素

• 模板纯度（含蛋白酶、酚、盐离子会抑制 Taq 酶）
• 模板浓度（过高非特异增加，过低无扩增）
• 模板结构（高 GC、发夹、重复序列难扩增）
• 模板完整性（降解严重会导致扩不出或片段偏小）

三、酶及其缓冲体系

• Taq 酶种类与浓度（普通酶、高保真酶、高 GC 酶）
• 酶量过高→非特异扩增；过低→产量低
• 缓冲液成分（KCl、Tris-HCl、稳定剂）
• 缓冲液 pH 值

四、dNTPs

• dNTP浓度（过高抑制酶，过低产量低）
• 四种 dNTP比例均衡
• dNTP纯度与降解程度

五、温度循环参数

• 变性温度与时间（94℃/95℃，不够则解链不完全）
• 退火温度与时间（决定特异性与效率）
• 延伸温度与时间（通常 72℃，片段长则需延长）
• 循环数（太少产量低，太多非特异累积）
• 预变性、终延伸步骤

六、反应体积与试剂加样

• 体系体积大小影响热传递速度
• 加样误差、试剂混匀程度

七、抑制剂与污染

• 样本中的抑制剂（血液中的血红素、植物多糖、腐殖酸）
• 外源污染（气溶胶、引物二聚体、外源 DNA）

八、PCR 仪硬件条件

• 升降温速度、孔间温度均一性
• 热盖是否有效（防止蒸发）

极简背诵版（考试简答直接写）