cDNA的筛选-2

（三）免疫筛选
制备Sepharose偶联细菌裂解液
1.各用一个E.coli温度敏感溶源菌株（BTA 282（λgt11amp3）或BNN 97）单菌落接种于2×7.5ml培养基并于32℃生长过夜。
2.过夜培养物用LB培养基稀释100倍，于32℃生长至OD600值为0.5。
3.于45℃温育15min诱导噬菌体表达。
4. 培养物于39℃进一步培养约2h。
5.测定噬菌体含量以便收集，氯仿测定操作步骤：3滴氯仿加到1ml培养物测试样品中，混合物于37℃温育。另一份不加氯仿的培养物作为平行对照。温育5min后，测试样品与对照比较。如果添加氯仿的测试细胞悬液清澈透明，细菌完全被吸附，刚好开始裂解，此时已可收集培养物。
6.于4℃以4000×g离心10min收获细菌。
7.从开始的两份7.5ml培养物离心得到的细胞沉淀用冷的偶联缓冲液重悬并再次离心。
8.各用5ml冷的偶联缓冲液重悬细胞沉淀。
9.超声波处理细胞悬液，直到粘度增加至不再释放出核酸。
10. 将细菌裂解物偶联到预先制备好的溴化氰活化Sepharose 4B于4℃过夜。
11. 以3000×g离心5min回收偶联物。
12. 用偶联缓冲液重悬沉淀并再次离心。
13. 为了饱和溴化氰活化Sepharose的未结合反应基团，沉淀物用冷（4℃）的饱和缓冲液重悬并在旋转轮上于4℃温育1h。
14. 通过三次连续的洗涤除去未吸附蛋白质，开始用洗涤缓冲液（pH4.0）；然后转换至pH8.0；最后一次洗涤 pH为4.0，在这个处理前后和每次洗涤之间，在4℃，2500×g离心5min，收集材料。
15. Sepharose偶联细菌裂解液可以 PBS悬液（＋0.01％硫柳贡）于4℃贮存几个星期。

用于筛选的抗体预吸附
1.浓度为0.5至 1 mg/ml未稀释的第一抗体和第二抗体（如过氧化物酶偶联羊抗兔抗体，Calbiochem公司）分别用1.7倍体积的Sepharose偶联细菌裂解液混合，并在旋转轮子上于4℃温育过夜。每次筛选循环约需要300μl已处理的第一抗体（最终工作稀释度为1：100）和15μl已处理的第二抗体（最终工作稀释度为1：2000）。
2.悬液加到少量玻璃棉填充的加样器吸头内。未封闭抗体用冷冻封闭液（至少5倍于柱体积）洗脱。
3. 用冷的封闭液调节洗脱出的抗体浓度至原先浓度的1/20。加入硫柳汞（终浓度0.01％）。

铺平板
1.如上所述铺制平板，作如下修改：
a. 另外一支含2.5ml顶层琼脂的12ml带螺旋盖试管置49℃水浴中以铺制诱导对照平板。
b. 在一份感染混合物中，用100μl噬菌体悬液含已知百分比的具有完整β-半乳糖苷酶基因的野生型噬菌体作为诱导对照。
c.在加相应感染混合物前，为铺制诱导对照平板20μl X-gal立即加到2.5ml顶层琼脂中。
2.于42℃温育3～4h（用E.coli Y1090）直至噬菌斑可见。
3.将平板移到层流橱内，用IPTG浸泡过的硝酸纤维素滤膜覆盖在上面以诱导噬菌体lacZ基因表达。对每个平皿，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上编号，然后在平皿内用IPTG溶液浸泡。排去平皿边缘多余的液体，然后从平板的中央开始往边缘小心地将滤膜放在长有细菌的平板上。滤膜总是用平头镊子操作。
4.于37℃温箱倒置培养过夜。
5.诱导对照平板上的某些噬菌斑过夜培养后，由于完整的β-半乳糖苷酶表达将变成蓝色，表明IPTG诱导成功。
6.从平板上剥离滤膜前，应该用针头在滤膜上标出3个不对称位置。
7.然后小心地从平板上剥离滤膜，接触面向上放在Whatman 3MM滤纸上，直至所有的滤膜揭下