利用PCR技术进行HSV基因检测，可提供单纯疱疹病毒在患者体内存在的直接证据;其灵敏度很高，可在数小时内做出检测报告，已成为临床诊断HSV感染或带毒状态的重要手段;但须在经过技术认证合格的实验医学实验室内进行，并在操作过程中注意避免污染。鉴于HSV-2隐性感染可能是男性不育的一个原因，对不育不孕门诊的就诊者，应将PCR技术检测HSV作为精液、宫颈液标本筛查的常规。
疑及新生儿患有宫内HSV感染者，血清(可采脐血或足跟血标本)IgM型HSV抗体检测阳性即可确诊。由于成年人群中有很高的HSV抗体检出率，大多获自隐性感染，且抗体的存在尚不能完全保护机体免受疱疹病毒的重复感染;故对于成人疑难病例，HSV抗体检测阳性对临床诊断帮助不大;然而HSV抗体检测阴性则有助于排除单纯疱疹(倘若受检者存在免疫应答功能缺陷，则不在此例)。
单纯疱疹病毒易于进行体外细胞培养，并能产生可见的细胞病变;故可用棉拭子在病损处采样或采集脑脊液等体液标本接种细胞，培养分离病毒作出诊断;并可采用细胞免疫组化、免疫荧光技术检测单纯疱疹病毒抗原蛋白，或原位杂交技术检测其基因成分，进一步进行HSV-1、HSV-2的分型。病毒细胞培养鉴定是HSV诊断的金标准，然而其技术条件要求较高，故难以在临床普遍推广。
组织病理早期表皮为网状变性的多房性水疱，聚合为单房性水疱，疱内有纤维蛋白、炎性细胞和气球变性细胞，核中可见嗜碱性包涵体(后期为嗜酸性)。真皮有炎性细胞浸润的患者可有血管炎改变。