疾病通路分析（Disease Pathway Analysis）

一、疾病通路分析的核心内容

1. 确定疾病相关基因 / 蛋白

• 数据来源：
  • 高通量组学数据：转录组（RNA-seq）、蛋白质组（质谱）、基因组（突变 / CNV）、代谢组等，筛选疾病与正常样本间的差异表达基因（DEGs）或变异基因。
  • 已知疾病基因数据库：OMIM（人类孟德尔遗传病数据库）、DisGeNET、GeneCards、GWAS Catalog（全基因组关联研究）。
• 关键基因识别：通过富集分析（如 GO、KEGG）、PPI 网络（蛋白互作网络）筛选枢纽基因（Hub Gene），或利用机器学习（如随机森林、LASSO）构建疾病预测模型。

2. 解析异常调控通路

• 经典信号通路：
  • 癌症：PI3K-AKT-mTOR、RAS-RAF-MEK-ERK、Wnt/β-catenin、p53 通路等。
  • 代谢疾病：AMPK、PPAR、胰岛素信号通路。
  • 免疫疾病：NF-κB、JAK-STAT、T 细胞受体信号通路。
• 通路异常模式：
  • 激活 / 抑制状态：通过磷酸化蛋白检测（如磷酸化 ELISA、Western blot）或通路报告基因实验（如荧光素酶报告基因）验证通路活性。
  • 上下游调控关系：利用因果推理算法（如 DAGs、贝叶斯网络）推断通路间的调控层级。

3. 通路间串扰（Crosstalk）分析

• 疾病通常涉及多通路协同异常，如肿瘤中血管生成（VEGF 通路）与细胞增殖（ERK 通路）的交互作用。
• 分析方法：
  • 通路互作网络：通过 StringDB、Reactome 等数据库构建通路 - 通路互作网络，识别核心交集节点（如共同调控的转录因子或激酶）。
  • 网络模块分析：利用 MCODE、ClueGO 等工具挖掘紧密关联的通路模块，揭示疾病的关键调控枢纽。

4. 细胞类型特异性通路

• 同一疾病在不同细胞类型中通路活性不同（如肿瘤微环境中免疫细胞与癌细胞的通路差异）。
• 分析方法：
  • 单细胞测序（scRNA-seq）：解析不同细胞亚群的通路激活状态（如肿瘤浸润免疫细胞的 NF-κB 通路活化）。
  • 空间转录组学：结合组织空间位置信息，定位通路异常的具体细胞类型及微环境。

二、疾病通路分析的常用方法

1. 通路富集分析（Pathway Enrichment Analysis）

• 目的：判断差异基因是否显著富集于已知通路中，识别疾病相关通路。
• 常用工具：
  • 基于超几何检验：clusterProfiler（R 包）、GSEA（基因集富集分析）。
  • 数据库：KEGG、Reactome、GO（生物过程）、PID（Pathway Interaction Database）。
• 示例：对癌症差异基因进行 KEGG 富集，发现 “癌症通路”“MAPK 信号通路” 显著富集。

2. 通路活性预测

• 基于基因表达的通路打分：
  • 单样本 GSEA（ssGSEA）：计算单个样本中通路基因的表达水平，生成通路活性评分。
  • 通路拓扑结构整合：考虑通路中基因的上下游关系（如利用 Pathway Commons 的通路拓扑数据），通过加权算法（如 NetPath）提升预测准确性。
• 工具：PROGENy（预测通路活性的机器学习模型）、DoRothEA（转录因子调控通路活性）。

3. 因果通路推断（Causal Pathway Inference）

• 目的：区分通路异常是疾病的驱动因素还是伴随现象，识别因果性通路。
• 方法：
  • 孟德尔随机化（MR）：利用遗传变异（如 SNP）作为工具变量，推断通路与疾病的因果关系（如利用 GWAS 数据验证炎症通路与冠心病的因果性）。
  • 扰动实验：通过 CRISPR-Cas9 敲除通路关键基因，观察细胞表型变化（如增殖、凋亡），验证通路的功能必要性。

4. 跨物种通路保守性分析

• 目的：利用模式生物（如小鼠、斑马鱼）数据推断人类疾病通路的保守性，辅助机制验证。
• 方法：
  • 同源基因映射：通过 OrthoDB、Ensembl Compara 获取物种间同源基因，比较通路在不同物种中的结构与功能差异。
  • 动物模型通路验证：在疾病模型动物（如肿瘤小鼠模型）中检测通路活性，与人类数据交叉验证。

三、常用工具与数据库

1. 通路数据库

2. 分析工具与平台

• 富集分析：clusterProfiler（R）、WebGestalt、Metascape（支持多组学数据整合）。
• 网络构建：Cytoscape（插件如 ClueGO、MCODE）、Gephi（可视化复杂网络）。
• 机器学习建模：PyTorch/TensorFlow（通路活性预测）、scikit-learn（分类 / 回归分析）。
• 单细胞分析：Seurat（细胞分群与通路活性分析）、Monocle（轨迹分析中的通路动态）。

四、应用场景

1. 疾病机制解析

• 案例：在阿尔茨海默病（AD）中，通过通路分析发现 β- 淀粉样蛋白（Aβ）沉积激活小胶质细胞的 NF-κB 炎症通路，进而加剧神经元损伤，揭示炎症与 AD 进展的关联。

2. 治疗靶点发现

• 策略：
  • 靶向异常激活通路：如癌症中抑制过度激活的 MEK 激酶（MEK 抑制剂用于 NRAS 突变肿瘤）。
  • 通路组合靶向：针对通路串扰设计联合用药方案（如同时抑制 PI3K 和 mTOR 以克服单一靶点耐药）。
• 工具：DGIdb（药物 - 基因相互作用数据库）、CTD（化学 - 毒性 - 疾病数据库）。

3. 生物标志物筛选

• 通过通路活性评分构建预后模型（如利用 GSEA 计算的 “上皮 - 间质转化” 通路评分预测癌症患者生存率）。

4. 药物重定位

• 分析现有药物的作用通路与疾病通路的重叠性（如利用 Connectivity Map 数据库，通过基因表达谱匹配发现老药新用机会，如二甲双胍通过 AMPK 通路用于癌症预防）。

五、挑战与前沿方向

1. 挑战

• 数据异质性：不同研究的组学数据存在技术偏差，需整合多源数据（如转录组 + 蛋白质组 + 临床数据）。
• 因果性 vs 相关性：通路富集结果多为相关性，需结合实验验证因果关系。
• 动态性与时空特异性：通路活性随疾病进展和组织微环境变化，传统静态分析难以捕捉。

2. 前沿方向

• 单细胞通路分析：解析单细胞分辨率下通路活性的异质性（如肿瘤单细胞中不同细胞亚群的 MAPK 通路激活差异）。
• 空间通路组学：结合空间转录组与蛋白质成像技术（如 CODEX、MIBI），定位通路活性的空间分布。
• AI 驱动的通路预测：利用深度学习（如图神经网络 GNN）建模通路 - 疾病关联，预测未知通路功能（如 AlphaFold2 扩展至通路动态模拟）。

总结