转录组分析技术进行差异表达分析时，如何筛选差异基因？

一、数据预处理与标准化

1. 数据过滤
   • 去除低质量 reads、接头污染和核糖体 RNA（rRNA）。
   • 对 RNA-seq 数据，通过比对（如 STAR、HISAT2）或定量工具（如 Salmon、Kallisto）获得基因表达量（如 FPKM、TPM 或原始计数）。
2. 标准化处理
   • 消除技术误差（如测序深度、样本间差异）：
     • 原始计数数据：使用DESeq2或edgeR中的标准化方法（如median-of-ratios或TMM）。
     • 表达量数据（如 TPM）：可直接进行对数转换（如log2(TPM+1)）。

二、差异表达分析的统计检验

1. 基于原始计数数据的工具

• DESeq2（基于负二项分布模型）
  • 步骤：
    1. 构建实验设计公式（如~group表示分组差异）。
    2. 拟合数据并估计离散度。
    3. 进行 Wald 检验或 likelihood ratio test（LRT）。
• edgeR（基于负二项分布，使用准似然法或精确检验）
  • 步骤：
    1. 通过DGEList对象导入计数数据。
    2. 标准化（TMM 方法）。
    3. 拟合广义线性模型（GLM）并进行glmFit和glmContrasts。
    4. 使用glmTreat或glmLRT识别差异基因。
• limma-voom（适用于少量样本，结合线性模型和经验贝叶斯方法）
  • 步骤：
    1. 将计数数据转换为对数 CPM（counts per million）并标准化。
    2. 使用voom函数构建权重矩阵。
    3. 通过limma的线性模型和eBayes检验识别差异基因。

2. 基于表达量数据的工具

• t 检验 / 方差分析（ANOVA）
  • 简单组间比较（如两组样本用 t 检验，多组用 ANOVA），需满足正态分布假设，可用limma包实现。
• 倍数变化（Fold Change, FC）筛选
  • 直接计算两组均值的比值（如 FC > 2 或 FC < 0.5），但需结合统计显著性（如 p 值）。

三、差异基因筛选的关键阈值

1. 统计显著性（p 值或调整后 p 值）
   • p 值校正：为控制多重检验误差（如成千上万基因同时检验），需将原始 p 值转换为调整后 p 值（如 FDR 或 q 值）。
   • 常用阈值：padj < 0.05（或q值 < 0.05）。
2. 生物学意义（表达量变化幅度）
   • 倍数变化（FC）：通常要求|log2(FC)| ≥ 1（即 FC ≥ 2 或 FC ≤ 0.5），但需根据研究领域调整（如某些低表达基因可能允许更低 FC）。

四、可视化与验证

1. 火山图（Volcano Plot）
   • X 轴：log2 (FC)；Y 轴：-log10 (p 值)。
   • 用颜色标记显著差异基因（如 padj <0.05 且 | log2 (FC)| ≥ 1），示例如下：
     
      

     

     
2. 热图（Heatmap）
   • 展示差异基因在样本中的表达模式聚类，验证组间一致性。
3. qPCR 验证
   • 对关键基因进行定量 PCR 实验，确认测序结果的准确性。

五、常用工具与代码示例（以 DESeq2 为例）

# 加载包
library(DESeq2)

# 构建DESeqDataSet对象（假设counts为原始计数矩阵，group为分组信息）
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = counts, 
                             colData = colData, 
                             design = ~ group)

# 差异表达分析
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds, contrast = c("group", "处理组", "对照组"))

# 筛选差异基因（阈值：padj < 0.05，|log2FC| ≥ 1）
resSig <- subset(res, padj < 0.05 & abs(log2FoldChange) ≥ 1)

# 结果排序
resOrdered <- resSig[order(resSig$padj), ]

六、注意事项

1. 样本量与重复：
   • 生物学重复（≥3）可提高统计效力，减少技术变异影响。
2. 数据分布假设：
   • RNA-seq 计数数据通常服从负二项分布，微阵列数据可能需正态转换。
3. 阈值灵活性：
   • 低表达基因（如 TPM < 1）可排除，避免噪声；或使用apeglm包进行效应值收缩（shrinkage）提高稳定性。
4. 功能富集分析：
   • 筛选后需对差异基因进行 GO/KEGG 富集分析，挖掘其生物学功能（如 clusterProfiler 包）。