全基因组测序（WGS）的实验流程是什么？

一、样本制备与 DNA 提取

1. 样本类型选择

• 常规样本：新鲜血液（EDTA 抗凝）、唾液（含口腔上皮细胞）、组织（新鲜 / 冰冻，避免 FFPE 样本的高降解率）。
• 特殊样本：肿瘤样本需分离肿瘤细胞（纯度≥20%，可通过显微切割或流式细胞术），避免正常细胞污染；ctDNA 样本需采集血浆（用 Streck 管保存，防止白细胞破裂释放 DNA）。

2. DNA 提取与质控

• 提取方法：
  • 血液 / 组织：磁珠法（如 QIAamp DNA Mini Kit）或柱提法，利用蛋白酶 K 消化细胞，分离基因组 DNA。
  • 体液（如血浆）：专用试剂盒（如 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit）提取游离 DNA（cfDNA）。
• 质控标准：
  • 浓度：Qubit 检测 DNA 浓度≥10 ng/μL（WGS 建议起始量≥1 μg）。
  • 纯度：NanoDrop 检测 OD260/280=1.8-2.0（纯 DNA），OD260/230>2.0（排除盐 / 有机物污染）。
  • 完整性：Agilent Bioanalyzer 检测 DNA 片段分布，主峰应≥20 kb（降解样本可能导致测序偏向短片段）。

二、文库构建（关键步骤）

1. DNA 片段化

• 物理打断：超声破碎仪（如 Covaris）将基因组 DNA 随机打断为300-500 bp的片段（通过调整超声时间控制片段长度）。
• 酶法打断：转座酶（如 Tn5）随机切割 DNA，适用于低起始量样本（如单细胞 DNA），但片段均一性略低于超声法。

2. 末端修复与加 A 尾

• 末端修复：使用 T4 DNA 聚合酶、Klenow 酶等修复打断产生的黏性末端，形成平末端。
• 加 A 尾：Klenow 片段（3'→5' 外切酶缺陷型）在 DNA 片段 3' 端添加单个腺嘌呤（A），便于后续接头连接（接头含互补的 T 尾）。

3. 接头连接与 PCR 扩增

• 接头连接：
  • 接头包含测序引物结合位点、样本条形码（Index）、测序平台适配序列（如 Illumina 的 Truseq 接头）。
  • 连接反应需优化温度（如 20℃过夜）和接头浓度，避免自连或连接效率不足。
• PCR 扩增：
  • 通过有限循环数（通常 10-15 个循环）扩增连接接头的 DNA 片段，富集目标文库并引入 Index（用于多重测序时区分样本）。
  • 注意：循环数过多会导致非特异性扩增和偏好性，需用 Qubit 定量后及时终止反应。

4. 文库质控

• 片段分布：Agilent Bioanalyzer 检测文库主峰是否符合预期（如 350-550 bp，含接头长度），排除小片段污染（如引物二聚体）。
• 浓度与总量：Qubit 测定文库浓度，计算总摩尔数（需换算为 nM），确保上机测序时浓度准确（如 Illumina NovaSeq 要求 2-4 nM）。

三、上机测序（以 Illumina 平台为例）

1. 测序模式选择

• 测序平台：
  • NovaSeq 6000：高通量，单次运行可测数百个样本，读长 2×150 bp 或 2×250 bp（PE150/PE250）。
  • HiSeq X Ten：高性价比，适合大规模人群队列研究，读长 2×150 bp。
• 测序深度：
  • 人类样本：
    • 普通 WGS：30×-50×（覆盖全基因组约 95% 区域，适用于变异检测）。
    • 高深度 WGS：100×+（适用于低丰度嵌合突变或肿瘤克隆进化研究）。
  • 计算公式：
    测序数据量（Gb）= 基因组大小（3 Gb）× 测序深度 × 1.2（冗余系数）。
    例：30× 深度需 3×30×1.2=108 Gb 数据量。

2. 簇生成与测序

• Flow Cell 制备：
  • 将文库 DNA 加载到 Flow Cell（含 8 个泳道 Lane），通过桥式 PCR 在芯片表面生成 DNA 簇（Cluster），每个簇对应单个 DNA 分子的扩增产物。
• 边合成边测序（SBS）：
  • 加入带荧光标记的 dNTP（A/T/C/G），每次循环读取一个碱基，通过光学信号识别序列（如 PE150 模式分 150 次循环读取正反向序列）。

四、数据产出与初步质控

1. 原始数据格式

• FASTQ 文件：包含序列（Read）和质量得分（Phred 值，Q30 对应错误率 0.1%），每个样本生成 2 个文件（R1 和 R2，双端测序）。
• 数据量计算：
  • 单样本 PE150 测序：1 Gb 数据≈3300 万条 Read（每条 Read 150×2=300 bp）。

2. 质量控制（QC）

• 工具：FastQC、MultiQC（批量质控）。
• 关键指标：
  • 碱基质量：平均 Q30 比例≥85%（优质数据），低质量区域（如末端）需过滤。
  • 接头污染：检测是否存在未完全切割的接头序列（>5% 需重新过滤）。
  • GC 含量分布：人类基因组 GC 含量约 42%，异常分布可能提示样本污染或建库偏差。
• 过滤处理：使用 Trimmomatic 或 Cutadapt 去除接头、低质量碱基（如切除 Phred<20 的末端碱基），保留≥50 bp 的有效 Read。

五、数据分析流程（生物信息学部分）

1. 序列比对（Mapping）

• 参考基因组：人类通常使用 hg38 或 hg19（UCSC 或 GRCh38 版本）。
• 工具：BWA-MEM（适用于短读长，速度快）或 Bowtie2（灵敏度高），将 Clean Read 比对到参考基因组，生成 BAM 文件。
• 质控：比对率≥95%（高质量样本），Duplication rate≤15%（过高提示 PCR 扩增过度）。

2. 变异检测（Variant Calling）

• 单核苷酸变异（SNV）/ 插入缺失（Indel）：
  • 流程：使用 GATK（最佳实践流程）或 SAMtools，经局部重比对（Realignment）、碱基质量校正（BQSR）后，调用变异位点，生成 VCF 文件。
• 结构变异（SV）：
  • 工具：Delly、Manta（基于比对片段的异常模式，如软剪切、配对读长异常），检测缺失、插入、倒位、易位等。
• 拷贝数变异（CNV）：
  • 工具：CNVnator、GATK CNV，通过测序深度分析基因组片段拷贝数变化。

3. 变异注释与解读

• 功能注释：ANNOVAR、VEP 等工具注释变异位点的基因组位置（如外显子、内含子、调控区）、基因功能、保守性（如 GERP 分数）。
• 临床意义：结合 ClinVar、OMIM、gnomAD 等数据库，判断变异是否为致病突变（如 PVS1+PM2+PP3 等 ACMG 标准评分）。

六、质量控制与验证（关键环节）

1. 生物信息学质控

• 覆盖度分析：Bedtools 统计全基因组各区域覆盖深度，确保≥90% 的基因组达到目标深度（如 30× 样本中≥90% 区域≥20×）。
• 连锁不平衡（LD）分析：群体研究中，通过 Haploview 检测 SNP 间连锁关系，评估数据与参考群体的一致性。

2. 实验验证

• Sanger 测序：对关键变异（如致病突变）进行 Sanger 验证，降低假阳性率（尤其适用于低频突变）。
• qPCR / 荧光原位杂交（FISH）：验证 CNV 或 SV 的真实性（如肿瘤中的 MYC 扩增）。

七、常见问题与优化策略

总结：WGS 实验流程的核心要点

1. 样本质量是基础：高质量 DNA（高浓度、高完整性）是获得可靠数据的前提，尤其注意肿瘤样本的细胞纯度。
2. 建库标准化：严格控制打断片段大小、接头浓度和 PCR 循环数，减少技术偏差。
3. 数据质控贯穿全程：从实验端的 DNA 质检到分析端的覆盖度评估，需多环节监控数据质量。
4. 技术互补：WGS 可结合长读长测序（如 PacBio）或单细胞测序，解决复杂结构变异或细胞异质性问题。