【有 效 性】有效
【法规名称】药品卫生检验方法（之三）
【颁布部门】卫生部
【颁布日期】1984年10月31日
【实施日期】1984年10月31日
【正 文】
七、破伤风杆菌检验法
以无菌手续取供试品约０．１ｇ共３份，分别加至０．１％葡萄糖庖肉培养基中（用前煮沸５分钟，迅速冷却），其中一管加０．０５ｍｌ（或少许）经３７°培养２—３天的阳性菌。置７５—８０°水浴保温２０分钟，然后置适宜的厌氧条件下（厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐或分别加入凡士林石蜡等量混合液，将液面盖住），于３５—３７°培养３—４天。如有厌氧菌生长，可产气、消化碎肉并有特殊臭气。具有上述现象之一者，应涂片作革兰氏染色镜检，分离培养并作毒力试验。若染色镜检发现具有破伤风杆菌芽孢形态，但毒力试验为阴性时，需将增菌液转种至０．１％葡萄糖庖肉培养基内，并同时在新霉素葡萄糖血平板上进行分离培养１—２次，以提高毒力。
选用１６—１８ｇ或１８—２２ｇ同性无孕的健康小白鼠３—５只，于后腿内侧皮下（肌肉）或背侧颈部皮下注射增菌液０．３—０．５ｍｌ，注射后６小时即可开始观察发病情况至４８小时。
凡供试品经增菌产毒培养后，涂片染色镜检为典型破伤风杆菌，并经毒力试验为阳性，应报告供试品检出破伤风杆菌。若镜检未发现典型破伤风杆菌，而毒力试验为阳性，也应按阳性结果报告。如毒力试验和镜检均为阴性时则报告为阴性结果。若经增毒培养后，毒力试验阴性而镜检虽为阳性时，则报告为阴性结果。（注意事项：凡从事破伤风杆菌检验的人员，应注射破伤风类毒素。作毒力试验时要戴手套。所用的物品必须经高压灭菌后洗涤）
供试品取样量：每批取两瓶或两盒以上的包装单位；贵重或微量包装的供试品，取样量可酌减。
３．分离法：也称烤螨法。将供试品放在特制的分离器或者附有孔径大小适宜的筛网的普通玻璃漏斗里，利用活螨避光，怕热的习性，在漏斗的广口上面放一个６０—１００瓦的灯泡，距离药品约６厘米处，照射１—２小时。活螨可沿着漏斗内的底部细颈内壁向下爬，可用小烧杯装半杯甘油水，放在漏斗的下口处，收集爬出来的活螨。
（２）有虫粉现象的药丸，也可用放大镜、双筒实体显微镜直接观察，或有漂浮法检查。
同时注意检查药瓶内壁与内盖有无活螨。
附１．螨标本的制作：
（１）水合氯醛 ７０克 阿拉伯胶粉８克
冰醋酸 ３毫升 甘油 ５毫升
麝香草酚 １克 蒸馏水 １０毫升
一、稀释剂
蒸馏水 １０００毫升
２．０．１Ｍ磷酸盐缓冲液
蒸馏水 １０００毫升
二、常用试剂和指示剂
甲基红 ０．１克
２．培立脱氏试剂（Ｖ·Ｐ反应测定用）
取氢氧化钾４０克，加蒸馏水至１００毫升。
纯戊醇 １５０毫升
用法：接种细菌于蛋白胨水培养基内，于３７°培养２４—４８小时。沿管壁加柯凡克氏试剂约０．３—０．５毫升，并轻轻摇动，若液面显玫瑰红色为阳性。
称取ＴＴＣ０．１克，加蒸馏水１０毫升溶解，１０磅３０分钟灭菌。
①精密称取亚碲酸钠１克，加至１００毫升新鲜煮沸并冷至５０°的蒸馏水中，溶解即得。
（二）常用的指示剂
称酚红０．５克研细，加１Ｎ氢氧化钠１．４３毫升使呈桔红色。加蒸馏水至２５０毫升使溶，即０．２％的酚红液，可作为尿素培养基的指示剂用。
４． １０％碱性复（品）红乙醇饱和溶液：
若将０．４％溴麝香草酚兰加蒸馏水稀释１０倍，即为０．０４％，可供测定ＰＨ用（变色范围ＰＨ６．０—７．６）。
称中性红１克研细，加９５％的乙醇６０毫升，溶解，加蒸馏水至１００毫升即得。
（一）革兰氏染色法：
结晶紫
蒸馏水 ８０毫升
碘化钾（ＫＩ） ２克
④复染液：
（１）涂片干燥：
（２）染色步骤：
④滴加沙黄染液或稀石炭酸复红液复染１分钟。水洗。滤纸吸干。
（３）染色结果：
①玻片必须洁净无油，以免影响涂片质量。
（二）鞭毛染色法（１）
石炭酸饱和溶液 ５毫升
（１）按无菌操作手续，取微量待检菌接种在蛋白胨水培养基中，置３７°培养箱内培养６—８小时备用。
１．染液制备：
２．染色方法：
（４）镜检：菌体及鞭毛皆染成茶色。
（３）防止水及培养物沾有氯化物。
（三）芽孢染色法：
２．染色方法：
１．肉汤培养基：
（１）成份：牛肉浸液（１∶３） １０００毫升 蛋白胨 １０克 氯化钠 ５克
注：牛肉膏３克加蒸馏水１０００毫升使溶可代替牛肉浸液（１∶３）１０００毫升。
３．０．００１％ＴＴＣ肉汤琼脂培养基（即０．００１％２、３、５氯化三苯基四氮唑琼脂培养基）：
（１）成份：牛肉膏 ３克 蛋白胨 １０克 氯化钠 ５克 琼脂 １８—２０克 蒸馏水 １０００毫升
４．虎红琼脂培养基：
（２）制法：将蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂混合，加热使琼脂熔化后加入葡萄糖溶解，过滤，加入虎红（四氯四碘萤光素）水溶液，分装，１０磅３０分钟灭菌。