共轭亚油酸的毒理学研究

 共轭亚油酸（conjugated linoleic cid，CLA），是指一类亚油酸的位置和空间共轭二烯异构体，其中cis-9，trans-11和trans-10，cis-12异构体被认为具有生理活性。两种异构体都是天然产物，其中cis-9，trans-11CLA，是饮食来源CLA的主要形式。共轭亚油酸是存在于人和动物体内的一种营养物质，20世纪80年代后期，美国科学家在研究烤牛肉中的致癌物质时，偶然发现了一种具有抗癌变作用的物质，后来的研究进一步发现，其还具有、抗动脉硬化、抗氧化 ［1～2］ 、提高免疫力、增加骨骼密度、降低人和动物体脂肪、增加肌肉 ［3～5］ 等生理功能。由于这是一种天然存在于人和动物中的活性物质，最近十几年来国际上活性脂类研究方面最活跃的领域之一。国外研究表明，共轭亚油酸在一定剂量下对健康人是安全的 ［6～7］ 。将CLA产品开发为食品或药品，必须进行相关的毒理学评价。因此，本文开展CLA毒理学研究，以期为将CLA开发成为功能食品和药品提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 样品

　　液体共轭亚油酸，共轭亚油酸含量71.77%（c9t11CLA，34.14%;10c12CLA，34.07%;其他CLA，3.56%），青岛澳海生物有限公司。共轭亚油酸标准品，sigma公司提供。

　　1.2 试验动物

　　二级昆明种小白鼠（医动字第01-3001号），二级Wistar大鼠（医动字第01-3008号）。购自中国医学科学院医学试验动物研究所试验动物繁殖场。以小鼠为材料进行毒理学试验;以大鼠为材料进行生理生化试验。

　　1.3 剂量选择

　　依人体推荐剂量为0.1g·kg -1 ·d -1 为依据，设定各试验项目、各试验组的大、小鼠饲喂CLA量，分别为2.50、5.00、10.00g/kg，相当于人推荐量的25、50、100倍。用花生油将样品配制所需浓度，同时设立普通对照组和模型对照组（均灌花生油），测各项指标。

　　1.4 试验方法

　　1.4.1 小鼠急性毒性试验

　　选择小鼠20只，雄性（♂）和雌性（♀）各10只，体重为18～22g。每天2次灌胃给予受试物，剂量为20g/kg，观察14天，记录动物中毒表现及死亡情况。

　　1.4.2 小鼠遗传毒性试验

　　1.4.2.1 艾姆斯（Ames）试验

　　试验菌株为鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102，体外活化系统为多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆制备的S-9混合液。根据毒性测定结果，试验设250、500、2500、5000μg/皿，共5个剂量，同时设立自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照组试剂分别为（1）疟的平，250μg/皿;（2）正丁霉素，50μg/皿;（3）叠氮钠，100μg/皿;（4）丝裂霉素，0.5μg/皿;（5）2-AF，50μg/皿。

　　1.4.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验

　　选择体重25 ～30g小鼠50只，随机分为5组，雌雄各半。3个试验组中受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg·bw，另设阴性对照组和阳性对照组（环磷酰胺，40mg/kg·bw）。采用间隔24h两次灌胃法试验，末次给予受试物后6h处死动物，常规制片。

　　1.4.2.3 小鼠精子畸形试验和精细胞染色体畸变试验

　　选择体重25～35g雄性小鼠50只，随机分为10组。6个试验组中受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg，另设阴性对照组和阳性对照组（环磷酰胺，40mg/kg）。灌胃给予受试物，连续5天，首次灌胃后第35天处死动物，常规制片。3组试验组及相应对照组，每只动物记数1000个结构完整的精子，记录畸变类型和数量，计算精子畸形率（%）。另外3组试验组及相应对照组，每只动物记数100个精细胞中期分裂相，记录畸变类型和数量，计算染色体畸变率（%）。1.4.3 大鼠喂养试验（30天） 选用体重40～60g断乳大鼠80只，随机分为4组，雌雄各半。3个实验组中受试物剂量分别为2.50、5.00、10.00g/kg，将受试物每天经口灌胃给予实验动物。对照组饲喂基础饲料并同时灌胃给予葵花籽油。记录大鼠进食量、体重，连续观察30天。

　　大鼠试验观察和指标测定。观察大鼠的一般表现、体重、食物利用率（%）。血常规及生化指标;病理解剖:脏器系数、观察及病理组织检查。

　　1.5 统计学方法

　　用Foxprow软件建立数据库，用EPI软件进行数据分析。
2 结果

　　2.1 小鼠急性毒性测定结果

　　灌胃给予受试物后，两种性别的小鼠均未见明显中毒症状，14天内动物无死亡。因此 认为，该受试物对两种性别小鼠的急性毒性半致死浓度LD 50 均>20g/kg，见表1。根据急性毒性分级标准，该液体CLA属实际无毒物质。表1 小鼠急性毒性结果（略）

　　2.2.1 Ames试验结果

　　第1次和第2次试验结果表明，受试物各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量-反应关系见表2，说明在加与不加S-9时受试样品对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102等株试验菌株均未呈现遗传毒性。表2 Ames试验结果 （略）

　　2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定结果

　　对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定结果。表明，受试物各剂量组微核率与阴性对照组之间差异无显著性，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组之间差异有非常显著。表明，受试样品对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核未产生作用。

　　2.2.3 小鼠精子畸形和精细胞染色体畸变测定结果

　　对小鼠精子畸形测定结果见表4。可见，受试物各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组之间差异无显著性，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组之间差异有非常显著性。说明，该受试样品没有致小鼠精子畸形作用。对小鼠精细胞染色体畸变测定结果见表5。可见，受试物各剂量组与阴性对照组之间差异无显著性，而阳性对照组与阴性对照组之间差异有显著性。说明，该样品未对小鼠精细胞染色体畸变产生影响。表3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果 （略）表4 小鼠精子畸形试验结果（略）表5 小鼠精细胞染色体畸变试验结果 （略）

　　2.3 大鼠喂养试验测定结果

　　2.3.1 大鼠的一般表现及体重、食物利用率测定结果

　　在大鼠喂养30天过程中，观察其行为，表明，大鼠未出现拒食现象，生长活动正常。体重和食物利用率测定结果说明，各试验组大鼠体重与对照组之间差异无显著性（P>0.05），各雄性试验组大鼠体重增重较对照组明显降低。各试验组动物进食量、食物利用率同对照组之间差异亦无显著性（P>0.05）。说明受试样品对大鼠的影响除体重降低外，其它生理活动无异常。

　　2.3.2 大鼠血常规及生化指标测定结果

　　对大鼠血常规和生化指标测定结果表明，各试验组的血红蛋白、红细胞记数、白细胞计数及其分类、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白等指标均 在正常范围之内，与阴性对照组之间差异均无显著性。 
 
　　2.3.3 大鼠组织病理学检查结果

　　喂养30天后的大鼠进行组织病理学检查结果表明，观察各试验组，未发现异常，解剖时亦未发现膀胱、肝总管结石，脏器系数未见异常。镜下观察对照组和各试验组动物的肝、脾、肾、十二肠、睾丸或卵巢等，均未见模型的病理改变。说明受试样品对大鼠内脏及其它组织均未造成病理改变。

　　3 讨论

　　对共轭亚油酸样品进行小鼠急性毒性试验、小鼠遗传毒性试验（Ames试验、骨髓嗜多染红细胞微核试验、精子畸形试验、睾丸染色体畸变试验）。结果表明，急性和遗传毒性测试均为阴性。对大鼠喂养30天的试验表明，内各试验组动物生长发育良好，体重、食物利用率、血常规、血生化、脏器系数等各项指标均在正常值范围内，与对照组之间差异无显著性。病理组织学检查也没有发现异常，表明该物质对大鼠各项观察指标未产生明显毒性作用。

　　Scimeca以大鼠为模型进行了36周试验，分别给予基础饲料，基础饲料加1.5%CLA。试验结果显示CLA未产生明显的毒性作用，持CLA进入GRAS（FDA基本认为安全）状态 ［6］ 。Berven研究了健康志愿者中共轭亚油酸（CLA）的安全性 ［7］ 。每天分别食用3.4g CLA或4.5g橄榄油。

　　两个试验组在异常事件和安全性指标差异无显著性，个体表现也差异无显著性。结果指出，受试剂量CLA对于健康人群是安全物质。

　　本研究表明，以人体推荐量的（0.1g/kg）的25～100倍的共轭亚油酸，喂养试验小鼠、大鼠均无明显毒性作用。为此，本研究结果为今后将CLA用于人类的保健或一些疑难病症的防治药物的开发研制，提供了科学依据。