【H 】G P T 4 -1 指导原则编号：
化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则
（第二稿）
二○○四年三月一日
1ഊ目录
一、概述……………………………………………………………………4
二、总则……………………………………………………………………4
三、刺激性试验……………………………………………………………5
㈠、定义……………………………………………………………………5
㈡、目的……………………………………………………………………5
㈢、刺激性试验设计中应考虑的问题……………………………………5
㈣、皮肤刺激性试验………………………………………………………6
㈤、注射给药部位刺激性试验……………………………………………6
㈥、眼刺激性试验…………………………………………………………6
㈦、其他途径给药部位刺激性试验………………………………………7
四、过敏性试验……………………………………………………………7
㈠、定义……………………………………………………………………7
㈡、目的……………………………………………………………………7
㈢、过敏性试验设计中应考虑的问题……………………………………7
㈣、经皮给药过敏性试验…………………………………………………8
㈤、注射给药过敏性试验…………………………………………………8
㈥、其他途径给药过敏性试验……………………………………………8
㈦、试验方法………………………………………………………………8
五、溶血性试验……………………………………………………………9
㈠、定义……………………………………………………………………9
㈡、目的……………………………………………………………………9
㈢、适用范围………………………………………………………………9
㈣、溶血性试验设计中应考虑的问题……………………………………9
㈤、试验方法………………………………………………………………9
六、试验报告………………………………………………………………9
七、结果评价………………………………………………………………9
八、关注的几个问题………………………………………………………10
九、参考文献………………………………………………………………10
十、附录……………………………………………………………………11
㈠、刺激性试验方法………………………………………………………11
2ഊ⒈皮肤刺激性试验………………………………………………………11
⒉注射给药部位刺激性试验……………………………………………13
⒊眼刺激性试验…………………………………………………………14
㈡、过敏性试验方法……………………………………………………17
⒈被动皮肤过敏试验……………………………………………………17
⒉全身主动过敏试验……………………………………………………17
⒊豚鼠最大化试验和Buehler 试验……………………………………19
⒋皮肤光毒性试验………………………………………………………21
⒌皮肤光过敏性试验……………………………………………………23
㈢、溶血性试验方法……………………………………………………23
⒈常规体外试管法（肉眼观察法）……………………………………23
⒉改进的体外溶血性试验法（分光光度法）…………………………25
十一、起草说明…………………………………………………………26
十二、著者………………………………………………………………28
3ഊ一、 概述
㈠、定义和目的
化学药物刺激性、过敏性和溶血性是指化学药物制剂经眼、耳、鼻、
口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、
静脉旁和鞘内等非口服途径给药，对用药局部产生的毒性（如刺激性和
过敏性等）和/或对全身产生的毒性（如过敏性和溶血性等）。它是临
床前安全性评价的组成部分。
药物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如pH
值、渗透压等）均有可能引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性的发生，
而严重的毒性可以影响用药的安全有效性，因此药物在临床应用前应研
究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应
用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标
并为临床解毒或解救措施提供参考，保障临床用药的安全有效。
㈡、适用范围
本原则适用于化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究。
㈢、主要内容
本指导原则的主要内容包括化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究
和评价的总体原则、一般原则和常用试验方法。
二、总则
化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究必须执行《药物非临床研究
质量管理规范》。
试验设计应遵循随机、对照、重复的原则。
化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究试验设计应结合毒性的发生
机制、影响因素、临床意义和药物临床应用的适应症和给药方法等来考
虑。动物种属的选择应依据拟采用的试验模型和观察的指标。动物的性
别、年龄和生理状态应符合拟采用试验方法的要求。试验用药物应与用
于人体的制剂一致。给药方式（包括剂量、途径和方案）应根据所采用
的试验模型和拟定临床应用的情况来决定。观察部位应选择给药部位，
同时考虑选择周围组织或可能暴露于受试药物的部位。
如果其他非临床安全性研究（如长期毒性）的受试物与拟进行临床
研究的制剂相同或具有可比性，其研究结果可反映化学药物刺激性、过
4ഊ敏性和溶血性中的某一毒性，则可不进行相应的毒性研究。
进行化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究时应尽可能明确受试物
的成分（包括主药、辅料和杂质等的名称和量）。
有相同给药途径上市制剂刺激性和/或过敏性和/或溶血性研究提
示有一定毒性时，应与已上市制剂进行比较性研究，毒性应相当或更小。
比较性研究的样本例数的确定应遵循统计学的基本原理。
由于动物试验存在一定的局限性，因此进行化学药物刺激性、过敏
性和溶血性评价时，应结合药学、药理、毒理及临床应用进行综合评价，
明确药物是否能进行临床应用及临床应用时应关注的问题等。
三、刺激性试验
㈠、定义
刺激性是指非口服药物制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症
改变，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。
㈡、目的
观察动物局部接触受试物后所产生的刺激反应，提示药物临床应用
后给药部位可能出现的炎症反应、组织的变性和坏死等不良反应。
㈢、刺激性试验设计中应考虑的问题
⒈实验动物的选择
依据观察指标和拟采用试验模型选择试验动物，一般每个试验选择
一种动物进行评价。
⒉给药的频率与期限
给药频率和期限应依据拟定临床应用的情况来决定。重复给药试
验，一般每天给药一次，给药期限最长不超过4 周。偶尔给药的受试物
可用单次给药的方法进行试验。
⒊可逆性观察
为明确毒性反应的恢复情况，建议进行停药后恢复期的观察。局部
毒性反应的可逆性评价应包括局部及相关部位的反应。
⒋受试物
受试物应与用于人体的制剂一致。
⒌对照组
以溶媒和/或赋形剂作为阴性对照。必要时采用阳性对照或已上市
5ഊ制剂。
⒍剂量
剂量设计主要应该考虑受试物浓度和总剂量。一般采用与临床制剂
相同浓度，设一个剂量组，可以通过改变给药频率进行剂量的调整，但
皮肤给药刺激性研究通过增加涂敷厚度或加大涂布面积来提高给药剂
量是不合适的。必要时应该进行不同浓度的刺激性试验。
⒎给药方式
7.1 给药方案应尽量与临床用药方案一致。
7.2 给药途径和给药部位应与临床用药一致。
7.3 设计给药容积，给药速率和给药频率时，应考虑所选用动物模
型给药部位的解剖和生理特点。
⒏只要相互之间不影响且全身耐受性许可，则可在同一动物身上进
行不同给药途径的刺激性试验研究，并可在对侧进行对照试验。
⒐数据统计：根据实验模型和试验方法选择合适的统计方法。
㈣、皮肤刺激性试验
⒈对于经皮给药制剂及可能接触皮肤的非口服给药制剂应考虑进
行皮肤刺激性试验。
⒉在急性毒性试验、长期毒性试验或皮肤过敏性试验中已经评价过
皮肤刺激性，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可
不必进行单独的皮肤刺激性试验。
⒊试验方法
参见附录中刺激性试验常用方法和相关文献。
㈤、注射给药部位刺激性试验
⒈对于注射剂应考虑进行注射给药部位刺激性试验。
⒉在急性毒性试验、长期毒性试验中已经评价过注射给药部位刺激
性，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不必进行
单独的注射给药部位刺激性试验。
⒊试验方法
参见附录中刺激性试验常用方法和相关文献。
㈥、眼刺激性试验
⒈眼用药物及可能接触眼睛的药物等均应考虑进行眼刺激性试验。
6ഊ⒉在急性毒性试验、长期毒性试验中已经评价过眼刺激性，其受试
物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不必进行单独的眼刺
激性试验。
⒊试验方法
参见附录中刺激性试验常用方法和相关文献。
㈦、其他途径给药部位刺激性试验
可在总则和刺激性试验设计中应考虑的问题的指导下参考皮肤、注
射给药部位和眼刺激性试验进行。
四、过敏性试验
㈠、定义
本指导原则中的过敏性是指变态反应又称超敏反应，指机体受同一
抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免
疫反应，是异常或病理性免疫反应。其分类采用目前普遍接受的分类法：
Ⅰ型又称快发或速发过敏型，由IgE 介导，主要表现为荨麻疹、过敏性
休克、支气管哮喘、变应性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应等；Ⅱ型又称
细胞毒型或溶细胞型，由IgG 介导，主要表现为库姆斯试验阳性的溶血
性贫血，粒细胞减少和血小板减少性紫癜；Ⅲ型又称免疫复合物型或血
管炎型，由IgG 、IgM 介导，主要表现为局限性肺炎、血管炎、狼疮样反
应、肾小球肾炎等；Ⅳ型又称迟发型或结核菌素型，由T 淋巴细胞介导，
主要表现为接触性皮炎。
光敏性包括光毒性（光刺激性）和光过敏性（光变态反应）两类，
光毒性是由光诱导的非免疫性的皮肤对光的反应，药物可通过直接作用
或通过血循环间接作用。光过敏性是获得性的免疫性介导的由光激活的
皮肤对光的反应，系光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的
光线在表皮细胞层发生的反应，为Ⅳ型变态反应的特殊类型。
㈡、目的
观察动物接触受试物后所产生的全身或局部过敏反应。
㈢、过敏性试验设计中应考虑的问题
⒈进行何种过敏性研究应根据药物自身特点（如化学结构等）、其
他药理毒理的实验结果，特别是长期毒性试验的结果、临床适应症及给
药方式等确定。
7ഊ⒉具体试验方法的选择应根据给药途径，以及需考察的过敏性可能
的发生机制确定，并应阐明合理性。如经皮给药需考虑做豚鼠最大化试
验（GPMT ）、Buehler 试验（BT ）；注射给药需考虑做全身主动过敏
试验（ASA ）和皮肤被动过敏试验（PCA ）；吸入给药需考虑做豚鼠吸
入诱导和刺激试验。
⒊剂量设计应合理，注意量效关系。应设立阳性和阴性对照组。
⒋若其他试验如长期毒性试验，已确定过敏反应类型，其受试物与
拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不再单独进行该类型过敏
反应的考察。
⒌由于实验动物模型的局限性，如目前仍无理想的Ⅱ和Ⅲ型过敏反
应的动物模型；光过敏性动物模型的临床意义尚不明确等，因此一些药
物的过敏性临床前评价可采取灵活的方式，但应有充分的理由，并应在
医师使用手册和说明书中详细描述其可能的毒性，临床研究时进行相应
的考察。
⒍数据统计：根据实验模型和试验方法选择合适的统计方法。
㈣、经皮给药过敏性试验
应考察皮肤过敏性反应，通常采用BT 或GPMT 或其他合理的试验方
法。若药物的化学结构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相
似者，尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应
（如全身过敏性反应等）。
㈤、注射给药过敏性试验
通常采用ASA 和PCA 或其他合理的方法考察全身过敏性反应，采
用其他方法应阐明合理性。若药物的化学结构与文献报道产生其他过敏
性反应的化合物相同或相似者，尚应考虑采取适当的试验方法以考察其
是否能引起其他过敏性反应（如皮肤过敏性反应等）。
㈥、其他途径给药过敏性试验
吸入途径药物应采用豚鼠吸入诱导和刺激试验。粘膜给药药物应结
合药物的自身特点参照经皮给药过敏性试验方法进行。若药物的化学结
构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相似者尚应考虑采取
适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应（如光敏反应等）。
㈦、试验方法
8ഊ参见附录中过敏性试验常用方法和相关文献。
五、溶血性试验
㈠、定义
溶血性是指药物制剂引起的血管外或血管内溶血和红细胞凝聚等
反应。溶血性反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物
通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为Ⅱ型和Ⅲ型过敏反应；非免疫
性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起血液稳
态的改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。
㈡、目的
考察药物是否能够引起血管外或血管内溶血和红细胞凝聚等反应。
㈢、适用范围
凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他药
物制剂均应进行溶血性试验。
㈣、溶血性试验设计中应考虑的问题
⒈溶血反应发生机制复杂，目前尚无标准的临床前体内试验方法以
全面评价药物制剂的溶血反应，因此推荐未有相同给药途径上市制剂在
长期毒性研究中兼顾考察制剂的溶血性。试验时应注意观察溶血反应的
有关指标及体征（如网织红细胞、红细胞数、胆红素、尿蛋白、肾炎和
脾脏淤血等），如出现溶血时，应进行进一步研究。
⒉对于已有相同给药途径上市注射剂常可采用常规体外试管法评
价药物的溶血性，若体外试管法试验结果为阳性，建议与相同给药途径
上市制剂进行比较性研究，必要时进行动物体内试验。
㈤、试验方法
参见附录中溶血性试验常用方法和相关文献。
六、试验报告
试验报告应符合GLP 实验室管理规范，内容包括：实验方法、受
试物、实验动物、实验步骤、观察指标、实验结果和结果评价。
七、结果评价
说明方法、受试物和动物选用的合理性并分析其对实验结果的可能
影响。
正确分析实验结果并理解实验结果的意义，判断毒性反应和毒性作
9ഊ用靶器官。
分析毒性试验的完整性，判断该毒性研究是否能较全面地反映药物
给药后产生的毒性，并分析引起毒性作用的可能原因。
结合药学、药理、毒理及临床应用进行综合评价，明确药物是否能
进行临床应用及临床应用时应关注的问题等。
八、关注的几个问题
对于化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究，有以下几个方面值得
关注。
⒈应体现整体性、综合性的原则
实际工作中应根据药物自身特点，通过结合药物的药学、药理、毒
理和临床研究工作进行刺激性、过敏性和溶血性研究和评价。
⒉具体情况具体分析
目前已有试验方法仍存在一定的局限性，因此我们可采用新方法以
提供更有价值的试验结果，提高刺激性、过敏性和溶血性研究预测的灵
敏性和准确性。但采用其他方法时应阐明其合理性并说明具体方法及操
作流程。
九、参考文献
⒈FDA Guidance for Industry Skin irritation and sensitization testing
of generic transdermal drug products
⒉FDA Guidance for Industry Photosafety testing
⒊FDA Guidance for Industry Immunotoxicology evaluation of
investigation new drug
⒋EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.7800 Immunotoxicity
⒌EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2500 Acute dermal
irritation
⒍EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2600 Skin
sensitization
⒎EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2400 Acute eye
irritation
⒏EMEA Non-clinical local tolerance testing of medicinal products
⒐ISO 10993-10:2002(E) Biological evaluation of medical devices-
10ഊPart 10- Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity
⒑中华人民共和国卫生部药政局新药（西药）临床及临床前研究
指导原则汇编
⒒徐叔云 卞如濂 陈修 药理实验方法学
⒓陈奇 中药药理研究方法学
十、附录
本附录中收载的试验方法仅供参考，研究者应根据所研究药物的自
身特点采用国内外公认的科学合理的试验方法，而并不仅限于附录中所
收载的试验方法。
㈠、刺激性试验方法
⒈皮肤刺激性试验
1.1 定义
皮肤刺激性是指动物经皮肤给予受试物后在皮肤上产生的可逆性
炎症改变，若产生了不可逆性的组织损伤则为皮肤腐蚀性。
1.2 目的
观察动物皮肤接触受试物后所产生的刺激反应，提示药物临床应用
后皮肤可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。
1.3 试验方法
1.3.1 试验动物：首选家兔，动物数4－8 只，雌、雄各半。应设赋
形剂对照，采用同体左右侧自身对比法。试验前24 小时对给药区（通
常在背部）进行脱毛处理（可剪、剃或用适宜的脱毛剂）。去毛范围左、
右各3 cm ×3 cm 。给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤
的皮肤不宜进行试验。但若需考察破损皮肤的刺激性，则可在用药部位
用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。
1.3.2 受试物的给予：取受试物0.5 ml 直接涂布于一侧已去毛的皮
肤上，然后用二层纱布（2.5 cm ×2.5 cm ）和一层玻璃纸或类似物覆盖，
再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋型剂做对照。贴敷时
间至少4 小时。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁
给药部位。多次给药皮肤刺激性试验应连续在同一部位给药，每次给药
时间相同，贴敷期限一般不超过4 周。
1.3.3 动物观察：在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。按表
11ഊ1 给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。
单次给药皮肤刺激性试验，在去除药物后30-60 分钟，24 、48 和
72 小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性
损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长
期一般不超过14 天。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期
结束时对给药局部进行病理组织学检查。
多次给药皮肤刺激性试验，在每次去除药物后1 小时以及再次贴敷
前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗
糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评
分。末次贴敷后，在去除药物后30-60 分钟，24 、48 和72 小时肉眼观
察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要
延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过
14 天。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局
部进行病理组织学检查。
1.3.4 结果评价：单次给药皮肤刺激性试验，计算每一观察时间点
各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值。将受试物皮肤反应积分
的平均分值减去赋形剂皮肤反应积分的平均分值得到原发性刺激指数，
按表2 进行刺激强度评价。
多次给药皮肤刺激性试验，首先计算每一观察时间点各组原发性刺
激积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物刺激积分均值即累积刺
激指数，按表2 进行刺激强度评价。
表1.皮肤刺激反应评分标准
刺激反应分值
红斑
无红斑0
轻度红斑（勉强可见）1
中度红斑（明显可见）2
重度红斑3
紫红色红斑到轻度焦痂形成4
水肿：
无水肿0
12ഊ轻度水肿（勉强可见）1
中度水肿（明显隆起）2
重度水肿（皮肤隆起1 mm ，轮廓清楚）3
严重水肿（皮肤隆起1 mm 以上并有扩大）4
最高总分值8
表2.皮肤刺激强度评价标准
分值评价
0-0.49 无刺激性
0.5-2.99 轻度刺激性
3.0-5.99 中度刺激性
6.0-8.0 强刺激性
1.4 试验报告
试验报告应符合GLP 实验室管理规范，内容包括：受试物名称、
理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来
源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来
源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；
每只动物在每一观察时间点的皮肤反应积分；具体描述其它毒性反应；
试验结论等。
1.5 试验结果的解释
该试验系统比人皮肤刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无
刺激性，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，
否则轻度刺激性可不予重视。
⒉注射给药部位刺激性试验
2.1 定义
注射给药部位刺激性是指动物经注射给予受试物后在注射部位产
生的可逆性组织改变，若产生了不可逆性的组织损伤则为腐蚀性。
2.2 目的
观察动物注射受试物后所产生的刺激性反应，提示药物临床应用后
注射部位可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。
2.3 试验方法
2.3.1 试验动物：首选家兔，动物数每组不少于3 只。应设生理盐
13ഊ水对照，可采用同体左右侧自身对比法。用药部位根据药物的给药途径
确定，可选用耳缘静脉，耳中心动脉（其它动物可选用前、后肢静脉及
股动脉等），股和背部肌肉，侧胸壁皮下组织，静脉旁组织等。
2.3.2 给药方法：按临床使用情况给予受试物，给药容积和速率应
根据动物情况进行相应的调整。给药期限应根据药物拟用于临床的情况
来决定，多次给药一般不超过7 天。
2.3.3 动物观察：单次给药刺激性试验，在给药后48-96 小时对动
物和注射部位进行肉眼观察；多次给药刺激性试验，每天给药前以及最
后一次给药后48-96 小时对动物和注射部位进行肉眼观察。观察期结束
时应对部分动物进行给药部位组织病理学检查。留下的动物根据受试物
的特点和刺激性反应情况，继续观察14－21 天再进行病理组织学检查，
以了解刺激性反应的可逆程度。
2.3.4 结果评价：根据肉眼观察和病理检查的结果，对受试物使用
的安全性进行评价。
2.4 试验报告
试验报告应符合GLP 实验室管理规范，内容包括：受试物名称、
理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来
源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来
源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；
每只动物在每一观察时间点的刺激反应情况；具体描述其它毒性反应；
试验结论等。
⒊眼刺激性试验
3.1 定义
眼刺激性是指动物经眼给予受试物后在眼前部表面产生的可逆性
组织改变，若产生了不可逆性的组织损伤则为腐蚀性。
3.2 目的
观察动物经眼给予受试物后所产生的刺激性反应，提示药物临床应
用后眼可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。
3.3 试验方法
3.3.1 试验动物：首选家兔，动物数每组不少于3 只。应设置生理
盐水对照组，可采用同体左右侧自身对比法。试验前24 小时内对每只
14ഊ动物的双眼进行检查（包括使用荧光素钠检查）。有眼睛刺激症状、角
膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于试验。
3.3.2 给药方法：每只眼睛滴入0.1 ml 或涂敷0.1 g 受试物，然后
轻合眼睑约10 s 。一般不需冲洗眼睛。用药周期应根据药物拟用于临床
的情况来决定，多次给药一般不超过4 周。
3.3.3 眼部观察：单次给药眼刺激试验，在给药后1 、24 、48 和72
小时对眼部进行检查；多次给药眼刺激试验，每天给药前以及最后一次
给药后1 、24 、48 和72 小时对眼部进行检查。如果在72 小时未见任何
刺激症状，试验则可结束。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限。
但一般不超过21 天。
可使用放大镜、裂隙灯、生物显微镜和其他合适的器械进行眼刺激
反应检查。在记录了24 h 的观察后，可进一步用荧光素染色检查。每次
检查，都应记录眼部反应的分值（见表3）。除了观察结膜、角膜和虹
膜外，其他所观察到的损伤也应记录和报告。
3.3.4 结果评价：按表3 的要求，将每一个观察时间每一动物的眼
角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除
以动物数，即得最后分值。按表4 判断其刺激程度。
表3 眼刺激反应分值标准
眼刺激反应分值
角膜
无混浊0
散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1
半透明区易分辨，虹膜模糊不清2
出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见3
角膜不透明，虹膜无法辨认4
虹膜
正常0
皱褶明显加深、充血、肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对
光仍有反应
1
出血/肉眼可见坏死/对光无反应（或其中一种）2
结膜
15ഊ充血（指睑结膜和球结膜）
血管正常0
血管充血呈鲜红色1
血管充血呈深红色，血管不易分辨2
弥漫性充血呈紫红色3
水肿
无水肿0
轻微水肿（含眼睑）1
明显水肿伴部分眼睑外翻2
水肿至眼睑近半闭合3
水肿至眼睑超过半闭合4
分泌物
无分泌物1
少量分泌物2
分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着3
分泌物使整个眼区潮湿或粘着4
最大总积分16
表4 眼刺激性评价标准
分值评价
0-3 无刺激性
4-8 轻度刺激性
9-12 中度刺激性
13-16 强度刺激性
3.4 试验报告
试验报告应符合GLP 实验室管理规范，内容包括：受试物名称、
理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来
源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来
源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；
每只动物在每一观察时间点的眼睛反应分值；具体描述其它毒性反应；
试验结论等。
3.5 试验结果的解释
16ഊ该试验系统比人眼睛刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无
刺激，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，
否则轻度刺激性可不予重视。
㈡、过敏性试验方法
⒈被动皮肤过敏试验（PCA ）
1.1 基本原理
将致敏动物的血清（内含丰富的IgE 抗体）皮内注射于正常动物。
IgE 与皮肤肥大细胞的Fc з 受体结合，使之被动致敏。当致敏抗原激发
时，引起局部肥大细胞释放过敏介质，从而使局部血管的通透性增加，
注入染料可渗出于皮丘，形成一个蓝斑。根据蓝斑范围或分光光度计法
测定，判定过敏反应程度。
1.2 试验动物：PCA 反应常用的动物是大鼠，亦用小鼠，有时根据
试验需要用家兔。因这些动物PCA 反应是由IgE 介导的。
1.3 试验分组：应设立阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组。阴
性对照组应给予同体积的溶媒，阳性对照组给予卵白蛋白或天花粉或已
知致敏阳性药物。每组动物数至少4 只。
1.4 致敏途径及方式：应按临床拟给药途径。隔日致敏一次，共5
次。末次致敏后10 天左右采血，2000 转/分离心10 分钟，分离血清，
-20 ℃保存，2 周内备用。
1.5 激发：上述各组抗血清一般用生理盐水稀释成1：2 、1：8 、1：
32 。在动物背部预先脱毛3 ×4 cm
2
的皮内注射各对应组的抗血清0.1 mL 。
经24 或48 小时后，各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的
0.5-1%伊文思兰染料共1 mL 。
1.6 测定及结果评价：30 分后麻醉处死各组动物，剪取背部皮肤，
测量皮肤内层的斑点大小，直径大于5 mm 者判定为阳性。
⒉全身主动过敏试验（ASA ）
2.1 基本原理
对致敏成立的动物体内，静脉注射抗原，观察抗原与IgE 抗体结合
17ഊ后导致肥大细胞、嗜碱性细胞脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏
反应。
2.2 目的
观察受试物经全身给药后对动物引起的过敏性反应。
2.3 试验方法
2.3.1 动物
通常选用体重为300-400 克的Hartley 种雄性豚鼠。
2.3.2 剂量组别
应设阴性对照组，阳性对照组，低剂量组和高剂量组。每组动物至
少4 只。
2.⒊3 致敏
2.3.3.1 致敏途径：按临床给药途径。
2.3.3.2 致敏次数：隔日一次，共5 次。
2.3.3.3 致敏剂量：
阴性对照组：给予同体积溶解药物的溶媒。
阳性对照组：给予1-5 mg /只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏
阳性物质。
低剂量组：给予临床最大剂量（/kg 或m
2
）。
高剂量组：低剂量的数倍量。
2.3.4 激发
2.3.4.1 激发途径：通常静脉内给药。
2.3.4.2 激发次数：末次注射后第10-14 日一次激发。
2.3.4.3 激发剂量：通常为致敏剂量的2-5 倍量。
2.3.5 观察指标
2.3.5.1 致敏期间：每日观察每只动物的症状。初次，最后一次致
敏和激发当日测定每组每只动物的体重。
2.3.5.2 激发：静脉注射后立刻至30 分钟，按表5 症状详细观察每
只动物的反应，症状的出现及消失时间。最长应观察3 小时。
表5 过敏反应症状
0 正常7 呼吸急促14 步态不稳
1 不安宁8 排尿15 跳跃
18ഊ2 立毛9 排粪16 喘息
3 发抖10 流泪17 痉挛
4 搔鼻11 呼吸困难18 横转
5 喷嚏12 罗音19 潮式呼吸
6 咳嗽13 紫癜20 死亡
表6 全身致敏性评价标准
0 -过敏反应阴性
1-4 症状+过敏反应弱阳性
1-10 症状++过敏反应阳性
1-19 症状+++过敏反应强阳性
20 ++++过敏反应极强阳性
⒊豚鼠最大化试验（GPMT ）和Buehler 试验（BT ）
⒊1 定义
试验动物皮内或涂皮给予诱导剂量，经过10－14 天的诱导期，此
时免疫反应发生，然后给予激发剂量，以观察是否出现了过敏反应。在
诱导期和攻击期的皮肤反应及其程度均应进行对比，并与伪处理组进行
比较。
⒊2 目的
观察受试物经皮给药后对动物引起皮肤过敏反应的可能性。
⒊3 试验方法
⒊3.1 实验动物
⒊3.1.1 种系 最好选择年轻成年的豚鼠，选择实验室常用的种系。
⒊3.1.2 饲养条件 试验温度为20 ±3 ℃，相对湿度30－70％，如
为人工照明，应该12 小时白天与12 小时黑夜交替，给予常规的实验室
饮食，不限制饮水，豚鼠应该给予足量的VitC 。
⒊3.1.3 动物数量和性别 动 物数量和性别取决于所选择的试验方
法，两种性别均可使用。如果使用雌性动物，应选择未产和未孕的动物。
Buehler 试验试验组不少于20 只、对照组不少于10 只。GPMT 试验试
验组不少于10 只、对照组不少于5 只，如果试验结果不能提示受试物
为致敏剂，则应继续进行试验研究，其中试验组不少于20 只、对照组
不少于10 只。
19ഊ⒊3.1.4 对照动物
⒊3.1.4.1 每6 个月，应用已知的轻－中度的阳性物质检测方法的
灵敏性和可靠性，轻－中度的致敏剂在加佐剂的试验中至少30%和不加
佐剂试验中至少15%应有反应。推荐的阳性物质有巯基苯并噻唑，苯佐
卡因，二硝基氯苯，331 环氧树脂等，也可以使用其它的阳性对照物。
⒊3.1.4.2 为了确保激发反应源于过敏性而非刺激性，应设立只有
溶剂的伪处理组，所选择的溶剂应不干扰或改变试验结果的判断。
⒊3.1.5 试验剂量 取决于所选择的方法。在Buehler 试验中，致敏
剂量应当足够高，以产生轻微的刺激性，激发剂量为不产生刺激性的最
高剂量。在GPMT 试验中，致敏剂量应足够高以产生轻－中度的皮肤刺
激性且能很好地全身耐受，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。
⒊3.1.6 动物的观察
⒊3.1.6.1 皮肤反应应分级并在方法学所确定的激发时间进行判定
和记录，一般为24 和48 小时。对于异常的反应，应相应地调整时间。
⒊3.1.6.2 记录开始和结束时的动物体重。
⒊3.1.7 试验步骤
⒊3.1.7.1 Buehler 试验在第0，6-8 和13-15 天用封闭片局部给药
以诱导，在第27-28 天在未给药的肋腹部贴6 小时以局部激发。去除封
闭片24 和48 小时后读取结果。如果结果难以判定，一周后再次激发，
可采用原来的对照组或新的对照组。
⒊3.1.7.2 GMPT 试验采用皮内注射给药，使用或者不使用佐剂进
行诱导，局部诱导5－8 天后，第20－22 天给予激发剂量24 小时，在
去除激发剂量24 和48 小时后读取结果。同Buehler 试验一样，如果结
果难以判定，一周后再次激发，如果初试选择的动物数量只有10 只而
结果难以判断时，应再增加10 只试验动物和5 只对照动物。
⒊3.1.7.3 试验组和对照组均采取盲法读取结果。
⒊3.1.7.4 建议采取用水或适当溶剂去除受试物，不应改变已经存
在的皮肤反应和表皮的完整性。
⒊3.1.7.5 根据试验方法，可采用剪、刮或脱毛的手段去除试验部
位的毛发。
⒊4 试验报告
20ഊ试验报告应该符合GLP 实验室管理规范，内容应该包括：受试物名
称、理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重
和来源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲
料来源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操
作；每个动物在诱发接触1 和24 小时以及激发接触后24 和48 小时的
皮肤反应结果，至少应给红斑和水肿分等级，记录任何异常反应，每一
组过敏的比例和每一动物过敏程度（轻、中和重）；试验结论等。
3.5 试验结果的解释
该试验系统比人皮肤过敏反应敏感，在豚鼠身上强过敏者在人身上
引起过敏反应的可能性很大，而在豚鼠身上弱过敏者有可能或不可能在
人身上引起过敏反应。
⒋皮肤光毒性试验
4.1 定义
光毒性反应是指药物吸收的紫外光能量在皮肤中释放导致皮肤损
伤的作用，即皮肤或全身接触或应用化学物质后，继而暴露于紫外线照
射下所引起的一种皮肤毒性反应。光毒性反应是光敏中最常见的一种副
反应。具有剂量依赖性，其临床表现与晒伤相似，表现为红斑、水肿、
皮肤瘙痒和色素沉着。严重者可产生局部坏死、溃烂或表皮脱落。一旦
发生，反应十分迅速，一般在光照24 小时左右或更短时间发生。
4.2 试验方法
4.2.1 试验动物：健康300-500g 白化或无毛豚鼠，至少14 只，雌
雄各半。
4.2.2 试验分组：将豚鼠按体重性别随机分为二组，即对照组4 只，
试验组10 只，雌雄各半。对照组在给予受试物和阳性对照药后不接受
光照，试验组则在给予受试物和阳性对照药后接受光照。
4.2.3 药物和给药剂量：阳性对照药可选用8-甲氧基补骨脂素；根
据受试物的溶解性、试验所需浓度、理化特性和动物局部、全身的耐受
性等确定给药剂量并说明理由。一般选用二种浓度，其中低浓度为临床
用药浓度。
4.2.4 给药方法：将背部去毛区划分为四个部位，每个部位按
0.025 ml （g ）/cm
2
给药。给药情况如下：
21ഊ组别部位给药处理光照射
1 溶剂或赋形剂否
2 受试物浓度1 否
3 受试物浓度2 否
对照组
4 阳性对照否
1 溶剂或赋形剂是
2 受试物浓度1 是
3 受试物浓度2 是
试验组
4 阳性对照是
给药后，立即将动物放到特制的制动器上以限制动物活动。在光照
前应尽量保证受试物及对照物有足够的时间穿透皮肤角质层，以与表皮
细胞发生作用，一般在60 min 左右为宜。给药后适当时间（一般0.5-4
小时），用温水或无刺激性的适宜溶剂除去对照组动物受试部位残留的
受试物或赋形剂，将动物放回笼子中。试验组动物受试部位残留的受试
物或赋形剂在光照后被清除。
4.2.5 光照方法：应利用对不同受试物敏感的波长段进行试验。应
先进行预试验，对照射剂量、光强度和照射时间及照距等进行确定。试
验时将动物放在光照台上固定并遮盖头部后，用适宜的光源（如水冷式
氙灯）照射适当长的时间。一般认为波长应在280-450 nm 的范围内，照
&nb