【H 】G P T 1 - 1 指导原则编号:
化学药物急性毒性研究技术指导原则
（第二稿）
二OO 四年三月一日ഊ急性毒性研究技术指导原则
目 录
一、概述 ····················2
二、基本原则····················3
三、研究内容·····················3
四、数据分析及评价·····················5
五、名词解释····················6
六、参考文献····················6
七、附录·····················7
八、起草说明······················17
九、著者·····················20
- 1 -ഊ急性毒性研究技术指导原则
一、概述
动物急性毒性试验是指动物一次或24 小时内多次给予受试物后，一定时间
内所产生的毒性反应。
所有拟用于人的药物通常需要进行动物急性毒性试验[1]。从新药开发的客观
规律来看，急性毒性试验处在毒理研究的早期阶段，所获得的信息有助于重复
给药毒性试验的剂量选择，初步揭示受试物可能的毒性作用靶器官，同时也会
暴露一些迟发的毒性反应。另外，急性毒性试验的结果有时可用作Ⅰ期临床试
验起始剂量选择的参考，并能提供一些与人类急性药物中毒相关的信息[1 ，2]。
由OECD （Organization of Economic Corporation and Development ）于1987
提出的动物急性毒性试验称为经典的急性毒性试验[3]，为新药的开发作出了重要
贡献。美国、欧盟、日本为了国际注册要求的统一协调，于1991 年召开了第一
次人用药品注册技术要求国际协调会（ICH1 ），对经典急性毒性试验进行了科
学、客观的分析与评价，认为经典急性毒性试验存在较大的局限性，有些要求
缺乏科学基础。各方在科学的基础上就急性毒性试验达成了共识：建议采用两
种啮齿类动物或一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物的严格设计的、单次给药
的、逐渐增加剂量的耐受性研究，取代啮齿类动物或非啮齿类动物半数致死量
（LD50 ）测定的要求[4]。在1997 年进行的第二次ICH 会议中，又对支持单次给
药临床试验的动物急性毒性试验进行了讨论 [5]。
我国在1993 年和2001 年分别发布了两版有关急性毒性试验的指导原则，
在我国的新药研发中发挥了重要作用。随着我国加入WTO ，国产新药进行国际
注册成为必然，这种情况下，技术指导原则应首先符合国际注册的要求。此次
制定本指导原则的目的是，在我国原指导原则的基础上，结合我国科研实践的
经验和具体情况，参考ICH 框架下三方各国的指导原则，制定出既符合我国国
情又符合国际注册要求的动物急性毒性研究技术指导原则。
本技术指导原则适用于化学药品的动物急性毒性研究。
- 2 -ഊ本指导原则重点阐述急性毒性试验中动物、剂量、给药途径选择的基本原
理；对所获得数据的分析及评价要求；以及其中所涉及的科学原理与制定本指
导原则的背景。
二、基本原则
（一）、具体问题具体分析的原则
急性毒性研究的试验设计应该在对于受试物的认知的基础上，根据化合物
的结构特点和理化性质，遵循“具体问题具体分析”的原则进行。
（二）、随机、对照、重复的原则
急性毒性试验应符合一般动物试验的基本原则，即随机、对照和重复的原
则。
三、研究内容
（一）、试验条件
根据《药品注册管理办法》（试行）的规定，药物的急性毒性研究必须执
行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP ）。
（二）、受试物[6]
急性毒性研究的受试物应能够代表临床试验受试物和上市药品，与临床试
验受试物和上市药品符合同一质量标准。受试物应标明名称、批号、来源、理
化性质、纯度、稳定性、保存条件和配制方法，并附有研制单位的自检报告。
所用辅料、溶剂、试剂等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。
如果终产品所使用原料药的纯度与试验所用产品具有显著差别，建议进行
相应的试验来说明其安全性。
某些情况下，会采用不同的剂型来改变活性物质的生物利用度（如对胃酸
不稳定的药物制成肠溶片），建议采用临床拟用的剂型进行试验。
如果受试物为复方制剂，建议进行各成分单独给药的试验和按复方制剂比
例联合给药的试验，以提示有无增毒作用，或是否出现新的毒性。
如果受试物在贮存条件下易发生降解，建议以含降解产物量最高的受试物
进行急性毒性试验，并与临床样品的急性毒性试验结果比较。
- 3 -ഊ（三）、动物[1, 2, 6,7]
1 、种属：不同种属的动物各有其特点，对同一药物的反应会有所不同。
在大鼠和小鼠中观察到的毒性反应基本相似，但犬与啮齿类动物间却差别很大，
啮齿类动物和非啮齿类动物急性毒性试验所得的结果，无论是质还是量上均会
差别很大。从充分暴露受试物毒性的角度考虑，应从啮齿类动物和非啮齿类动
物中获得较为充分的安全信息。因此，急性毒性试验应采用至少两种哺乳动物，
根据药物的特点，可选用一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物进行试验。
2 、性别：通常采用两种性别的动物进行试验。
3 、年龄：通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于儿童，建
议考虑采用幼年动物进行相应的毒理试验。
4 、动物数：对于所用的动物数，应根据动物的种属和试验目的来确定，
通常小动物的每组数目相对多于大动物的数目。动物数选择的一般原则是在获
得尽量多信息的前提下，使用尽量少的动物数。动物数应符合结果分析评价的
要求。
5 、体重：动物初始体重不应超过或低于平均体重的20%。
可根据试验的目的及受试物的特点，确定试验动物的性别和年龄等。动物
应符合国家有关规定的等级要求，并具有实验动物质量合格证。
（四）、给药途径[1, 2, 6, 7]
给药途径不同，受试物的吸收率、吸收速度和暴露量会有所不同，因此需
要采用多种给药途径进行急性毒性试验。另外，通过不同途径给药所得结果的
比较，可以获得一些初步的生物利用度信息。通常，给药途径应至少包括临床
拟用途径和一种能使原型药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。如果临
床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。
（五）、给药剂量水平[1, 2, 6, 7]
急性毒性试验的重点在于观察动物出现的毒性反应，应以近似致死剂量下
观察出现的毒性和剂量间的量效关系为主。可选择适当的方法进行急性毒性评
- 4 -ഊ价，对于非啮齿类动物给予出现明显毒性的剂量即可，给药剂量没有必要达到
致死水平。
对于毒性较大的或需要参考LD50 值来估计临床初始剂量的药物，研究者根
据药物的具体情况设计给药剂量水平，可采用适当的方法求算LD50 值。
总体上，给药剂量应从未见毒性剂量到出现严重毒性 ((危及生命的)剂量，
同时设阴性对照组（溶剂对照组）。
（六）、观察时间及指标[1, 2, 4, 7]
给 药后，连续观察至少14 天，观察的间隔和频率应适当，以便能观察到毒
性指征出现的时间及其恢复时间，死亡时间等。观察的指标包括一般指标（如
动物外观、行为、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反
应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间
可多次称重）等。记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、
严重程度、持续时间、是否可逆等。对于所有的试验动物均应进行大体解剖，
包括实验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及试验结束时仍存活而处
死的动物。任何器官出现体积、颜色、纹理改变时，均应记录并进行组织病理
学检查。
四、数据分析及评价
（一）、结果处理和分析
1 、根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各
种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种
反应的量效关系及随时间的变化。
2 、参考附录一[8]，判断出现的各种反应可能涉及的器官、组织或系统等。
3 、根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可
能的毒性靶器官。组织病理学检查应附有病理学检查负责人签字的报告及有病
变组织的病理照片。
- 5 -ഊ4 、根据不同剂量组各种反应的发生率、动物死亡情况等，确定动物对受试
物的最大无反应剂量、最小毒性反应剂量、最大耐受剂量、最小致死剂量等，
初步判断药物的安全范围。
5 、对于需要测定LD50 值的药物，采用合理的统计学方法求算LD50 值。
6 、说明所使用的计算方法和统计学方法，提供所选用方法合理性的依据。
（二）、综合评价及与临床研究的关系
根据各种反应在不同剂量下的出现的时间、发生率、量效关系、不同种属
动物及实验室的历史背景数据、病理学检查的结果以及同类药物的特点，判断
所出现的反应与药物作用的相关性。总结受试物的安全范围、出现毒性的严重
程度及可恢复性；根据毒性可能涉及的部位，综合大体解剖和组织病理学检查
的结果，初步判断毒性作用靶器官。
急性毒性试验的结果可作为后续毒理研究剂量选择的参考，也可提示一些
后续毒性试验需要重点观察的指标。对于新药开发来说，可根据不同给药途径
动物的反应情况，初步判断受试物的生物利用度，为剂型开发提供参考。
五、名词解释
最大无反应剂量：受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用现代
的检测方法和最灵敏的观察指标不能发现任何损害作用的最高剂量。又称作未
见反应剂量（No observed effect level, NOEL ）或未见不良反应剂量（No observed
adverse effect level, NOAEL ）。
最小毒性反应剂量：观察动物出现毒性反应的最小剂量。
最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD ）：不引起受试对象死亡的最高
剂量。
最小致死剂量（Minimal lethal dose, MLD ）：引起个别受试动物出现死亡的
剂量
半数致死量（Median lethal dose, LD50 ）：在一定试验条件下引起50%动物
死亡的剂量。该值是经统计学处理所得的结果。
- 6 -ഊ六、参考文献
1. Guidance for industry: single dose acute toxicity testing for pharmaceuticals
(Final). FDA ，1996.
2. 单回投于毒性试验。见：日本临床前研究指导原则解说。药事日报社，2002 ：
11-14
3. 急性毒性试验。见：周综灿主编，毒理学基础，第二版。北京医科大学出
版社。北京，2000: 65-74
4. Outcome - Single dose toxicity. In: P.F. D’Arcy and D.W.G. Harron edited,
Proceedings of the First International Conference on Harmonization. Brussels
1991: 184
5. Single dose toxicity studies to support single dose trials/use in human. In: P.F.
D’Arcy and D.W.G. Harron edited, Proceedings of the Fourth International
Conference on Harmonization. Brussels 1997:286-288
6. Single dose toxicity. European Union ，Medicinal Products for Human Use
Guidelines (3BS1a), 1987
7. Cordier A. Single dose toxicity: Industry perspectives. In: P.F. D’Arcy and
D.W.G. Harron edited, Proceedings of the First International Conference on
Harmonization. Brussels 1991: 189-191
8. Acute toxicity and eye irritancy. In: A. Wallace Hays edited, Principles and
methods of toxicology. Fourth edition, 2001:853-916
9. Acute oral toxicity-fixed dose procedure. OECD guideline for testing of
chemicals. 2001
10. British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report:
a new approach to the classification of substances and preparations on the basis
of their acute toxicology. Human Toxicol, 1984 (3): 85-92
11. OECD Guidelines for testing of chemicals. Guideline 425: Acute Oral
Toxicity-Up and Down Procedure.
12. EPA OPPTS Harmonized Test guideline 870.1100 Acute Oral Toxicity.
- 7 -ഊ七、附录
（一）、急性毒性试验的一般观察和指征[8]
以下列出了一些常见的观察指征及其可能损伤部位。该表格仅作为结果分
析评价的参考，其他科学、合理的分析均是可以接受的；该表格中所列的观察
指征并不是急性毒性试验所必需要求的。
观察 指 征 可能涉及的器官、组织、系统
呼吸困难：呼吸困难或费力，喘息，通
常呼吸频率较低：
1. 腹式呼吸：隔膜呼吸，吸气时腹部
明显偏斜。
CNS*的呼吸中枢，肋肌麻痹，
胆碱能神经麻痹。 A.
2.喘息：用力深吸气，有明显的吸气声。CNS 的呼吸中枢，肺水肿，呼吸
道分泌物蓄积，胆碱功能增强。
B.
呼吸暂停：用力呼吸后出现短暂的呼吸
停止。
CNS 的呼吸中枢，肺心功能不
足。
C. 紫绀：尾部、口和足垫呈现蓝色。 肺心功能不足，肺水肿。
D. 呼吸急促：呼吸快而浅。 呼吸中枢刺激，肺心功能不足。
I. 鼻孔呼吸
阻塞，呼吸频
率和深度改
变，体表颜色
改变。
E. 鼻分泌物：红色或无色。 肺水肿，出血。
A.
自发活动、刺探、梳理毛发、运动增加
或减少。 躯体运动 ，CNS 。
B.
困倦：动物出现昏睡，但易被警醒而恢
复正常活动。 CNS 的睡眠中枢。
C. 正常反射消失，翻正反射消失。 CNS ，感官，神经肌肉
D. 麻痹：正常反射和疼痛反射消失。 CNS ，感官。
E. 强直性昏厥：无论如何放置，姿势不变。CNS ，感官，神经肌肉，自主神
经
F.
运动失调：动物走动时不能控制和协调
运动，但无痉挛、局部麻痹或僵硬。 CNS ，感官，自主神经
G.
异常运动: 痉挛，足尖步态，踏脚、忙
碌、低伏。 CNS ，感官，神经肌肉
H. 俯卧：不移动，腹部贴地。 CNS ，感官，神经肌肉
I. 震颤：包括四肢和全身的颤抖和震颤。神经肌肉，CNS
II. 运动功能：
运动频率和特
点的改变。
J.
肌束震颤：背部、肩部、后肢和足部肌
肉的运动。 神经肌肉，CNS ，自主神经
A.
阵挛性抽搐：肌肉收缩和松弛交替性痉
挛。
CNS ，呼吸衰竭，神经肌肉，自
主神经
B.
强直性抽搐：肌肉持续性收缩，后肢僵
硬性伸展。
CNS ，呼吸衰竭，神经肌肉，自
主神经
C.
强直性—阵挛性抽搐：两种类型抽搐交
替出现。
CNS ，呼吸衰竭，神经肌肉，自
主神经
D.
昏厥性抽搐：通常是阵挛性抽搐并伴有
喘息和紫绀。
CNS ，呼吸衰竭，神经肌肉，自
主神经
III. 抽搐(惊
厥)：随意肌明
显的无意识收
缩或惊厥性收
缩
E. 角弓反张: 僵直性发作，背部弓起，CNS ，呼吸衰竭，神经肌肉，自
- 8 -ഊ头抬起向后。 主神经
A.
角膜眼睑闭合：接触角膜导致眼睑闭
合。 感官，神经肌肉
B.
基本反射: 轻轻敲打外耳内侧，导致外
耳扭动。 感官，神经肌肉
C. 正位反射：翻正反射 CNS ，感官，神经肌肉
D.
牵张反射：后肢从某一表面边缘掉下时
收回的能力。 感官，神经肌肉
E. 光反射(瞳孔反射)；见光瞳孔收缩。 感官，神经肌肉，自主神经
IV. 反射
F.
惊跳反射：对外部刺激(如触摸、噪声)
的反应。 感官，神经肌肉
A. 流泪：眼泪过多，澄清或有色 自主神经
B. 缩瞳：无论有无光线，瞳孔缩小。 自主神经
C. 散瞳：无论有无光线，瞳孔扩大。 自主神经
D. 眼球突出 自主神经
E.
上睑下垂：上睑下垂，刺激后动物不能
恢复正常。 自主神经
F. 血泪：眼泪呈红色。 自主神经，出血，感染
G. 上眼睑松弛 自主神经
V. 眼检指征
H. 结膜浑浊，虹膜炎，结膜炎 眼睛刺激性
A. 心动过缓 自主神经，肺心功能低下
B. 心动过速 自主神经，肺心功能低下
C.
血管扩张：皮肤、尾巴、舌头、耳朵、
足垫、结膜、阴囊发红，体温高。
自主神经、CNS 、心输出量增加，
环境温度高
D. 血管收缩：皮肤苍白，体温低。 自主神经、CNS 、心输出量降低，
环境温度低
VI. 心血管指
征
E. 心律不齐：心律异常 CNS 、自主神经、肺心功能低下，
心肌缺血
VII. 唾液分
泌 A. 唾液分泌过多：口周围毛发潮湿 自主神经
VIII. 竖毛 A. 毛囊立毛肌收缩 自主神经
IX. 痛觉丧失 A. 对痛觉刺激反应性降低 (如热板) 感官，CNS
A. 张力降低：肌张力普遍降低 自主神经
X. 肌张力
B. 张力增加：肌张力普遍增加 自主神经
XI. 胃肠指征
A. 固体，干燥，量少 自主神经，便秘，胃肠动力 排便(大便) B. 流动性降低，水样便 自主神经，痢疾，胃肠动力
呕吐 A. 呕吐或恶心 感官，CNS, 自主神经(大鼠无呕
吐)
A. 红色尿 肾脏损伤 多尿
B. 尿失禁 自主感官
A. 水肿：组织液体充盈肿胀 刺激性，肾脏功能衰竭，组织损
伤，长期不动 XII. 皮肤
B. 红斑：皮肤发红 刺激性，炎症，致敏
* CNS: 中枢神经系统。
- 9 -ഊ（二）、急性毒性试验常用试验方法
由于受试物的化学结构、活性成分的含量各异，毒性反应的强弱也不同，
实验者可根据受试物的特点，选择以下方法或国内外公认的试验方法进行试验
均可。
另外，在本指导原则中仅简单介绍常用的试验方法，详细的试验技术细节
可参考相应的文献。
1 、最大耐受量法
一般使用10-20 只动物，连续观察14 天。
2 、最大给药量法
对于某些低毒的受试物可采取该方法。在合理的给药浓度及合理的给药容
量的条件下，以允许的最大剂量单次给药或24 小时内数次给药(一般不超过
5g/kg 体重)，观察动物出现的反应。一般使用10-20 只动物，连续观察14 天。
3 、半数致死量法
4 、固定剂量法（Fixed-dose procedure ）[9]
该方法最初于1984 年由英国毒理学会提出[10]，不以死亡作为观察终点，而
是以明显的毒性体征作为终点进行评价。
试验选择5 、50 、500 和2000mg/kg 四个固定剂量进行实验，特殊情况下可
增加5000 mg/kg 剂量。实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12 小时，给受试物后
再禁食3-4 小时。采用一次给药的方式进行。如无资料证明雄性动物对受药试物
更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试物的有关资料，由上述四个剂量
中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg 作初始剂量进行
预试，如无毒性反应，则用2000 mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结
束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，
如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给
一只动物，预试一般不超过5 只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24 小时。
给受试物后的观察期至少7 天，如动物的毒性反应到第7 天仍然存在，尚应继
续观察7 天。
- 10 -ഊ在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用10 只动物，雌雄各半。
根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不
引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，5.0mg/kg 引起死亡，则降低一个
剂量档次进行试验。
给受试物后至少应观察2 周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。对每
只动物均应仔细观察和详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。给受试物当
天至少应观察记录两次，以后可每天一次。观察记录的内容包括皮肤、粘膜、
毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等。动物死亡时
间的记录要准确。给予受试物前、后各1 周、动物死亡及试验结束时应称取动
物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应
作病理组织学检查。固定剂量试验法所获得的结果，参考下表标准进行评价。
固定剂量法试验结果的评价
试 验 结 果 剂量
(mg/kg) 存活数<100% 100%存活毒性表现明显100%存活无明显中毒表现
5.0 高毒(Very toxic)
(LD50 ≤25mg/kg)
有毒（Toxic ）
（LD50 25-200mg/kg ）
用50mg/kg 试验
50.0
有毒或高毒，用
5mg/kg 进行试验
有害（Harmful ）
（LD50 200-2000mg/kg ）
用500mg/kg 试验
500.0
有毒或有害，用
50mg/kg 试验 LD50>2000mg/kg 用2000mg/kg 试验
2000.0 用500mg/kg 试验 该化合物无严重急性中毒的危险性
5 、上下法（阶梯法，序贯法，Up and Down Method ）[11,12]
该方法由Dixon 和Mood 首次提出，1985 年Bruce 进行了改进，目前是OECD
和EPA 推荐的方法之一。其最大的特点是节省实验动物，同时，不但可以进行毒
性表现的观察，还可以估算LD50 及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药
物。该方法分为限度实验和主实验。限度试验主要用于有资料提示受试物可能
没有毒性的情况。可以从与受试物相关的化合物或相似的混合物或产品中获得
- 11 -ഊ相关毒性资料。在相关毒性资料很少或没有时，或预期受试物有毒性时，应进
行主试验。
限度试验：是最多用5 只动物进行的一个序列试验。试验剂量为2000 mg/kg ，
特殊情况下也可使用5000 mg/kg 。
2000 mg/kg 剂量水平的限度试验: 将受试物给予1 只动物。如果该动物死
亡，则进行主试验；如果该动物存活，依次将受试物给予另外4 只动物，动物
总数为5 只。如果1 只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他
动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死
亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价: 有3 只或3 只以
上动物死亡时，LD50 小于2000mg/kg ；有3 只或3 只以上动物存活时，LD50 大于
2000 mg/kg ；如果有3 只动物死亡，则进行主试验。
5000mg/kg 剂量水平的限度试验: 特殊情况下，才可考虑使用5000 mg/kg 的
剂量。将受试物给予1 只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物
存活，将受试物给予另外2 只动物。如果这2 只动物都存活，则LD50 大于5000
mg/kg ，停止试验（即不再对其他动物给药，观察14 天）。如果这2 只动物中
有1 只动物死亡或者2 只动物均死亡，将受试物给予另外2 只动物，一次1 只。
如果1 只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对
所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与
其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价。有3 只或3 只以上动物死亡
时，LD50 小于5000 mg/kg ；有3 只或3 只以上动物存活时，LD50 大于5000 mg/kg 。
主试验: 由一个设定的给药程序组成，在此程序中，间隔至少48 小时，每
次给药1 只动物。但给药间隔取决于毒性出现时间、持续时间和毒性的严重程
度。在确信前一只动物给药后能存活之前，应推迟按下一剂量给药。时间间隔
可以适当调整，但使用单一时间间隔时，进行试验会更简便。
第一只动物的给药剂量低于LD50 的最接近的估计值。如果该动物存活，第
二只动物给予高一级剂量；如果第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物
给予低一级剂量。剂量级数因子应选定为1/（剂量-反应曲线斜率估计值）的反
- 12 -ഊ对数（对应于斜率2 的级数因子为3.2 ），并应在整个试验过程中保持不变。当
没有受试物的斜率的有关资料时，使用3.2 为剂量级数因子。使用默认级数因子
时，剂量应从以下序列中选择：1.75 、5.5 、17.5 、55 、175 、550 、2000 mg/kg （或
有特殊要求时1.75 、5.5 、17.5 、55 、175 、550 、1750 、5000 mg/kg ）。如果没有
受试物的致死估计值，应该从175 mg/kg 开始。如果预期动物对该受试物的耐受
程度变化很大（即，估计斜率小于2.0 ），那么开始试验前应考虑增加剂量级数
因子超过按对数剂量计算的默认值0.5 （即，级数因子为3.2 ）。同样，对于已
知斜率很陡的受试物，应选择小于默认值的级数因子。
在决定是否和如何对下一只动物给药之前，每只动物都应认真观察达48 小
时。当满足停止试验标准之一时，停止给药，同时根据终止时所有动物的状态
计算LD50 估计值和置信区间。 用最大可能性法计算LD50 值 (美国EPA 开发了相
应的计算软件，AOT425StatPgm)。
当满足下列停止试验标准之一时，停止试验：
（a ）连续3 只动物存活；
（b ）任意连续6 只试验动物中有5 只连续发生存活/死亡转换；
（c ）第一只动物发生转换之后至少有4 只动物进入实验，并且通过计算
LD50 估算值的范围超出临界值（2.5 倍）。（首次转换的第四只动物之后，对每
次给药进行计算）
对于LD50 和斜率的各种组合，在动物发生死亡/存活转换之后，用4~6 只动
物即可满足停止试验标准（C ）。但在一些情况下，化合物的剂量-反应曲线的
斜率较小，可能另外还需要增加动物（总共可达15 只）。
以上为该试验方法的概述，详细的实验方法可参见相应参考文献[11]。
用于该方法的LD50 计算软件可从以下地址免费下载：
http://www.epa.gov/oppfead1/harmonization/
6 、近似致死剂量法 (Approximate Lethal Dose – ALD)
该方法主要用于非啮齿类的动物试验。实验方法如下：
- 13 -ഊ实验动物一般用6 只健康的Beagle 犬或猴。犬的年龄一般为4-6 月龄，猴
的年龄一般为2-3 岁，选用其他物种的动物时应说明理由。
估计可能的毒性范围：根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和
其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。
按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。
根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间
隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之
间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂
量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高
非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。
7 、累积剂量设计法（金字塔法，Pyramiding dosage design ）
在非啮齿类动物进行急性毒性实验可采用此方法。经典的实验设计需要8
只动物，分对照组和给药组，每组4 只动物，雌雄各2 只。
剂量的设计可以是1 、3 、10 、30 、100 、300 、1000 、3000 mg/kg ，也可以
采用10 、20 、40 、80 、160 、320 、640 、1280 mg/kg ，通常隔日给予下一个高剂
量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时止。
当没有动物死亡时，MLD 和LD50 大于最高剂量或限制剂量。当在某一剂量
所有动物均出现死亡时，MLD 和LD50 应在最后两个剂量之间。当在某一剂量部
分动物出现死亡，部分死亡出现在后继的下一个高剂量，此时，MLD 位于首次
出现死亡的剂量和前一低剂量之间，LD50 则应在首次出现动物死亡的剂量和所
有动物均死亡的剂量之间。假如没有动物死亡发生，常常以最高剂量给予动物
5-7 天，以确定后续的重复给药实验中高剂量的选择。
- 14 -ഊ(三)、ICH 三方急性毒性试验指导原则简介
虽然在第一次ICH 时已经就急性毒性试验达成了共识，各国在ICH 的总体
框架下修订了其指导原则，但各国的指导原则仍然存在差异。
1 、FDA 急性毒性试验指导原则简述
目前FDA 急性毒性试验指导原则为1996 年发布的正式版。FDA 认为，所
有拟用于人的药物通常需要进行动物急性毒性试验。主张使用最少的动物获得
最大的信息，不推荐使用大量动物计算致死参数。
给药剂量要求从未见毒性剂量到出现重大毒性 (危及生命的) 剂量。毒性低
的化合物，应给予最大可行剂量。给药途径为临床拟用途径加静脉途径(如果可
行的话)。如果临床拟用途径为静脉，只此一种途径即可。至少两种哺乳动物，
其中包括一种非啮齿类动物。通常可用少量的啮齿类动物 (如，每组每性别3-5
只动物) 既能达到急性毒性试验的目的。如果使用非啮齿类动物，动物数应更少。
对非啮齿类动物，所有能提供急性信息的资料均可使用，其中包括重复给药毒
性试验剂量探索试验的数据。
药后观察14 天，记录所有的死亡、症状、开始时间、持续时间、毒性是否
可逆等。对于所有的动物均应进行大体解剖，包括因垂死而处死的动物、死亡
的动物以及14 天结束时的动物。
另外，如果急性毒性试验拟用于支持人体单次给药/药代动力学研究安全性
时，应设计该试验来评价量效关系和药代动力学。在试验早期和终点时进行临
床病理学和组织学监测(最好能在出现最大毒性和恢复时)。
2 、欧盟指导原则
目前欧盟网站上发布的指导原则仍然是1987 年发布的急性毒性试验指导原
则，故在此不做介绍。
3 、日本急性毒性试验指导原则简述
日本在2002 年新发布了其临床前研究指导原则解说。该解说认为动物急性
毒性试验的目的是为重复给药毒性试验的剂量选择提供参考。不要求在啮齿类
- 15 -ഊ动物中测定LD50 ，应以观察给药后出现的毒性与给药剂量间关系为重点。用尽
量少的动物获得充分的信息。
要求采用两种以上的动物进行急性毒性试验，一种为啮齿类动物，一种为
除家兔外的非啮齿类动物。对动物数无明确规定。如果用于研究性别、年龄、
饮食对毒性的影响，动物可灵活考虑。
给药剂量水平的选择较为复杂：在预实验中，如果经口给药、经皮给药剂
量为2000 mg/kg 、吸入给药为5 mg/L 时，动物出现了死亡，则按常规设计进行
试验。如果受试物毒性较低，在上述剂量时未见毒性反应，就没有必要设其他
剂量组进行试验。非经口给药途径给药剂量可以参考经口给药2000 mg/kg 的标
准。如果毒性较小，没有必要一定求出最低致死剂量。如果经口给药的致死剂
量小于300 mg/kg ，皮下注射小于200 mg/kg ，静脉注射低于100 mg/kg ，可认为
毒性较大，应测定LD50 值。
药后观察14 天，对于肉眼可见的病变组织，进行组织病理学观察。
- 16 -ഊ八、起草说明
（一）、起草背景
我国在1991 年和2001 年分别发布了两版有关急性毒性试验的指导原则，
在我国的新药研发中发挥了重要作用。随着我国加入WTO ，国产新药进行国际
注册成为必然，这种情况下，技术指导原则应首先符合国际注册的要求。此次
制定本指导原则的目的是，在我国原指导原则的基础上，结合我国科研实践的
经验和具体情况，参考ICH 框架下三方各国的指导原则，制定出既符合我国国
情又符合国际注册要求的动物急性毒性研究技术指导原则。
2003 年11 月1 日到2 日在江苏泰州由课题研究组全体成员，对课题组起草
的《急性毒性研究技术指导原则》（第一稿）（草案）进行讨论，就课题组提
出的主要问题基本达成了一致，并提出了修改意见和建议。综合专家提出的修
改意见和建议，对第一稿进行了修改形成修改稿，提交课题研究组成员。根据
课题研究组成员反馈的修改意见，经过讨论综合归纳，形成了此第二稿。
（二）、有关LD50 的要求
从目前的情况看，FDA 的指导原则中已经不再要求LD50 了，而日本也不是
所有的药物均要求提供LD50 值。在此次起草的指导原则中，我们参考ICH 有关会
议的情况和国外的指导原则确定LD50 的求算不再是急性毒性试验的必需要求
了，研究者可根据药物的具体情况选择相应的试验方法和观察指标。但是，对
毒性较大的药物以及细胞毒类的抗癌药物（通常根据LD50 值推测I 期临床试验的
起始剂量），要求提供较准确的LD50 值。在第一次ICH 会议上，根据各方新药研
发与注册的经验，就急性毒性试验的科学意义、科学基础等进行了讨论，得出
了一致结论，认为LD50 不再是急性毒性试验的一般要求了，急性毒性试验的重
点是暴露动物在死亡之前出现的毒性及其与剂量的关系等。
以下为第一次ICH 会议上对LD50 讨论的会议纪要：
经典的急性毒性试验，由OECD 于 1987 提出：动物首选大鼠，至少设3 个
剂量组，每组每性别至少5 只动物，组间应有适当的剂量间距，给药后产生一
系列毒性和死亡率，以得到剂量-效应关系和LD50 。认为LD50 试验具有多种意义：
- 17 -ഊ①标化药物强度，评价药物对机体毒性的大小，比较不同药物毒性的大小。② 计
算药物的治疗指数，安全系数，区分有效的药物和有毒的药物。③ 是后续重复
给药毒理试验剂量选择的参考。④ 通过比较不同途径的LD50 值，获得一些生物
利用度的信息。⑤ 试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后的症状，为
临床毒副反应监测提供参考。
经典的急性毒性试验及其LD50 值的精确测定曾经是各国药品注册法规的重
要组成成分，在新药的开发注册中发挥了重要作用，但随着科学的进步，越来
越多的新药研发机构和管理当局意识到了经典的急性毒性试验存在的局限性：
① 对于上述的绝大多数目的，LD50 值均不能给予有效的信息，其可用性十分有
限。对于亚急性毒性试验中的剂量选择，一个简单的使用很少动物的重复给药
预试验将会提供更有用的信息。② 从生物学的角度看，LD50 没有恒定的数值。
早在很多年前，Zbinden 教授指出，LD50 的数值依赖于多种内部和外部因素。不
同的试验条件、试验机构、研究中心对于同一药品所得出的结果差别较大，可
达2.44 - 8.38 倍。③ 通常急性毒性试验所用的剂量与临床人用剂量差别很大，
所以不能期望使用急性毒性试验的结果来拟定人的临床剂量。④ 人和动物对药
物的敏感性差别很大，如人和小鼠的致死剂量相差很大。根据误服或过量服药
致人死亡的事件，推算16 种化学药品的人致死剂量小于小鼠LD50 值的1/10 。例
如，东莨菪碱、阿托品，人的致死剂量分别小于小鼠LD50 的1253 和250 倍。对
于急救医生和中毒控制中心，LD50 试验的结果对于医学诊断和治疗意义较小。
⑤ 由于LD50 造成了不必要的动物和资源的浪费，因此LD50 的求算受到了广泛的
伦理学和科学的批评。⑥ 对于开发新药来说，通常没有必要求出精确的LD50 值，
所要关注的是动物出现的毒性和剂量间的量效关系，在啮齿类动物中不再需要
给以致死水平的剂量。但特殊的情况下，从科学的角度需要测定LD50 值，如细
胞毒类抗癌药物，通常用LD50 的1/10 来估计I 期临床试验的安全起始剂量。这种
情况下，就需要测定出较为准确的LD50 值。
该次ICH 会议的结论如下：① 在三地区中，“经典”的LD50 测定已不再是
单剂量毒性试验的正式要求了。② 目前申报资料要求建议进行逐渐增加剂量的
- 18 -ഊ耐受性研究，以监测不同剂量下的毒性反应。③ 建议采用两种哺乳动物。可以
用两种啮齿类动物或一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物的严格设计的、单次
给药的、逐渐增加剂量的耐受性研究，取代啮齿类动物或非啮齿类动物LD50 测
定的要求。④ 如果相关的话，ICH 建议应用药理学上相关的主要代谢产物应进
行单次给药的毒性研究。但对于代谢产物的急性毒性试验，仍然存在一些分歧。
有人认为因为长期毒性试验已经充分地覆盖代谢产物，代谢产物急性毒性的作
用受到了怀疑。因此，代谢产物的急性毒性试验不应成为一般性的要求，但对
于特殊的情况，根据药理学特点可能是合适的。
（三）、其他与原指导原则的主要不同点
1 、增加了对受试物质量的要求。新药的研发是一个不断发展的过程，合成
路线、工艺等的改变可能会使得新条件下的终产物在纯度等方面发生改变。因
此所用的受试物应能代表临床试验和上市药品，纯度应具有可比性。
另外，对几种可能遇到的特殊情况进行了相应的要求，如剂型的问题、复方
制剂的问题和降解产物的问题。
2 、增加了动物选择的基本原则。本指导原则中主要阐释动物选择的基本原
则，试验者从充分暴露受试物毒性的角度考虑，应从啮齿类动物和非啮齿类动
物中获得较为充分的安全信息，要求采用至少两种哺乳动物进行。根据药物的
具体情况，可选用非啮齿类大动物进行试验，如Beagle 犬或猴。对于所用的动
物数，应根据动物的种属、试验目的、所采用的试验方法等来确定。动物数越
少越易观察，各国指导原则的一般要求是在获得尽量多的信息前提下，使用尽
量少的动物数。这也是动物保护和节省资源的考虑。
3 、增加了给药途径的选择基本原则。给药途径应至少包括临床拟用途径和
一种能使原型药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。各国指导原则所要
求的给药途径有所不同，除临床拟用途径外，日本主要为经口给药，加拿大和
美国为静脉注射。如果临床拟用途径为静脉注射，则仅此一种途径即可。
4 、强调急性毒性试验的观察为全程观察，包括毒性的起始、持续和结束，
而非仅仅结果观察（死亡率）。根据国际上通常的要求，急性毒性试验的周期
- 19 -ഊ至少为14 天，大体解剖应包括所有动物，但仅肉眼观察有病变的组织进行组织
病理学检查并提供病理照片。
5 、本指导原则中强化了急性毒性的过程观察和病理学检查，在结果分析上
增加了较为科学的相关指标。所使用的计算方法和统计学方法不宜做统一规定，
应根据试验方法等具体情况选择并应说明选择的合理性依据。综合评价也是新
引入的概念。从研发的角度，试验完成了并不等于对药物的评价结束了。应根
据结果进行分析判断，甚至要结合其他毒性试验和有效性试验综合判断，为后
续开发及临床研究提供参考。
6 、丰富了附录的内容。附录一为毒性指征与可能涉及的器官、组织、系统
的对照，值得注意是该表格仅作为参考，其他科学、合理的分析均是可以接受
的，同时也不是急性毒性试验所要求的观察指标的列表。
附录二是常见的试验方法，主要简单介绍一些常用的试验方法，如果需要
具体的技术细节可以查阅相关文献。由于受试物的化学结构、活性成分的含量
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