李保国 周伟伟 （上海理工大学低温生物与食品冷冻研究所，上海 200093）
摘要：由生物工程生产的生物药品，具有疗效好，副作用小，可治疗疑难杂症而受到关注，为保持生物活性和保证疗效，生物药品大多采用真空冷冻干燥进行干燥。本文综述了生物药品冷冻干燥过程的关键问题、蛋白变性失活与防止问题。
关键词：生物药品；冷冻干燥；综述
Study on Freeze-drying of Biopharmaceutical Products
Li Bao-guo， Zhou Wei-wei
(Institute of Cryobiology Eng.，University of Shanghai for Science and Technology，Shangha 200093)
Abstract：There are good curative effect and little side effect of biopharmaceutical products， some difficulty mixed diseases can be treat， so it is paied close attention. In this paper， some major problems such as protein denaturalization and deactivation are summarized.
Key Words：biopharmaceutical；freeze drying；summarized.
1 生物药品冷冻干燥的意义
随着分子生物学、免疫学、生物技术分析以及生物工程学的发展，生物新药研究与开发，已成为21世纪发展的新的领域。2001年全球生物药物市场总额达220亿美元，据预测，前20名生物技术公司2004年和2006年的销售额将分别达到189.26亿美元和224.16亿美元[1，2]。以高技术、高内涵、高活性、治疗用途广、疗效确切的生物技术和基因工程新药的发展，将对我国医药工业和临床治疗是一个重要的机遇和挑战。
生物药品主要包括蛋白类药品、激素、病毒、疫苗、细菌、酵母、抗生素、抑制剂、脂质体等。在生物药品领域，冷冻干燥技术是一项极为重要的制剂工艺，据文献报道，约有14%的抗生素类药品需要冻干，约有92%的生物大分子类药品需要冻干，约有52%其它生物制剂需要冻干[3]。生物药品冷冻干燥过程是将含水药品冻结成固态后，在低温、真空状态下，使其中水分升华或解吸出去，以达到药品能长期保存的一种方法。药品冻干技术涉及到传热传质学、制冷技术、真空技术、自动控制、生物化学、药剂学等学科。对生物药品的冷冻干燥与冻干过程中动态参数测量及控制方法的研究对提高医药工业技术水平具有特殊重要的意义。
2 生物药品冷冻干燥的特点及关键问题
2.1 生物药品冷冻干燥的特点
药品冷冻干燥技术与其它干燥方法相比具有以下几个特点[4]：
（1）冻干在低温下进行，能最大程度避免生物蛋白、激素、疫苗等药品中的活性成份产生变性或失去生物活力。
（2）冻干在真空下进行，氧气含量小，能使药品中易氧化的物质得到保护，挥发性成份能得以尽可能的减少。
（3）药品冻干后能最好地保持药品原来的形状，具有较高复水速率。
（4）冻干可除去药品中95%以上的水分，使其能在室温或相对较高温度下长期保存。
不足之处是：冻干设备的初期投资较大、冻干过程能耗较高。但由于冻干具有其它干燥所无法比拟的诸多优点，在生物制药工程领域有着广泛的应用[6]。
2.2 生物药品冷冻干燥的关键问题
生物药品冻干过程中必需考虑三个方面的问题，一是如何保证冻干过程的顺利进行，二是如何减少冻干过程对生物药品药效的影响，三是如何降低生物药品冻干过程的能耗。综合这三个方面的因素，药品冷冻干燥过程中的关键技术可概括如下：
（1） 冻干过程中样品温度控制及对干燥进程的判断。在冻干过程中，样品温度不能控制的过高，温度过高样品会出现溶融、塌陷或皱缩问题。但在低温条件下，样品温度每下降1K，干燥时间至少增加13%[3]。所以在保证产品质量的前提下，应使产品升华界面的温度尽量高，这样才能使升华速率尽提高，冻干时间缩短。
（2）预冻过程中的降温速率。预冻过程中，冰晶生长造成药品溶液溶质的迁移，当样品温度达到共晶温度时，溶质开始析出，此时，溶质因析出前冰晶的形成与生长而形成网状结构，溶质所形成的网状结构干燥后样品的多孔性网状结构。不同降温速率，形成的冰晶大小、溶质的网状结构不同，干燥升华速率和干后样品结构也不同 [7，8]。所以，预冻过程在很大程度上决定了冻干过程的快慢和冻干产品的质量。不同生物制剂最佳的降温速率各不相同，如蛋白多肽类药物的冻干通常慢速冻干是有利的[22]，而对于病毒、疫苗通常快速降温是有利的[23]。
（3）冻干保护剂种类与浓度。不同生物制剂中的活性成分分子结构各不相同，使用的冻干保护剂种类与浓度也各不相同，保护剂的种类与浓度决定着冻干产品的有效性和稳定性。目前，还没有找到一种通用的冻干保护剂。对任一种新药生物制剂的冻干，选择其合适的冻干保护剂都是一项极为重要的工作。
3 生物药品冻干工艺控制参数与冻干保护剂
3.1 共晶点温度Te、玻璃化转变温度Tg和塌陷温度Tc
共晶点温度Te、玻璃化转变温度Tg和塌陷温度Tc是冻干工艺参数控制中最重要的三个参数。三参数即相互独立，又具有一定的联系，三参数对冻干工艺控制设计有重要的意义。
（1） 共晶点温度Te。共晶点温度指在溶液降温过程中，当溶液被冷却到冰点时，开始析出固相的冰，随着温度的降低，液相中的溶质浓度不断增加，当温度降低到一定程度时，溶液中的溶质全部固化，并和冰共存时的温度称为共晶点温度。
(2）玻璃化转变温度Tg。玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种固体状态，粘度极大，一般为1012～1014Pa.s，是固化了的液体，但由于粘度大，分子运动受到限制，流动性差。当液体被固化成玻璃态时的温度称为玻璃化转变温度。如果初始浓度较高，且降温速率很高，溶液来不及析出冰，冻结过程中，溶质不出现结晶析出现象，而是趋向一种由液态－橡胶态－玻璃态的转变[9]。
（3）塌陷温度Tc。所谓塌陷温度是药品在干燥过程中，干燥层温度上升到一定数值时，其部分干燥物质所形成的多孔性骨架刚度降低，干燥层内颗粒出现脱落，直至骨架塌陷的温度Tc。干燥物从骨架上脱落或骨架塌陷会封闭了已干部分的海绵状微孔，阻止升华的进行，使升华速率减慢，最终可导致冻干产品的残余水分含量过高，产品的复水性与稳定性较差。
（4）冻干工艺控制与三温度参数。一般来说，塌陷温度Tc比共晶温度Te稍高，共晶温度Te较玻璃化温度Tg高。Fukuoka等[75]认为，在多数情况下，塌陷温度Tc要比玻璃化转变温度Tg高20K左右[38，39]。当然，对于一给定的冻干样品，其塌陷温度Tc、共晶温度Te和玻璃化温度Tg要通过具体的实验得到。DSC是传统的测定共晶温度和玻璃化转变温度的方法，它具有迅速、准确、样品用量少、灵敏度高等优点[10]。塌陷温度可通过冻干显微镜测得。
至于冻干过程中，是控制冻结层温度低于共晶温度，还是控制冻结温度低于玻璃化转变温度，主要决定于样品冻干过程中需要固化的状态。若样品需要固化于玻璃态，则样品冻干过程中，冻结层温度要低于其玻璃化转变温度，若样品不需要固化于玻璃态，则样品冻干过程中，冻结层温度低于其共晶温度即可。由于水溶液的玻璃化转变温度较共晶温度低10~30K，所以不必要固化于玻璃态的样品冻干控制过程中，控制样品冻结层温度低于共晶温度即可。
在冻干干燥过程中，干燥层的温度要始终低于其塌陷温度Tc。对于搁板加热式冻干机，升华干燥过程中，只要控制样品冻结层的温度低于其共晶温度或玻璃化转变温度，其干燥层的温度一般不超过其塌陷温度。而对于辐射加热的冻干机，塌陷温度是工艺过程控制中的一个重要参数。
3.2 冻干过程中的压力控制
在冻干过程中，升华的水蒸气从升华界面通过多孔干燥层时的阻力，比由干燥层外表面到水汽凝结器的阻力大6~10倍，这说明多孔干燥层的阻力是水蒸气迁移的主要阻力。冻干室内压力控制的高低对升华速率的影响取决定于两方面因素：一方面冻干室内压力降低，水蒸气迁移势差增大，升华速率提高；另一方面，冻干室内压力降低，加热板通过室内气体换热对样品的加热能力降低，升华界面温度就会下降，升华速率反而会下降。
Mellor[46，47]提出循环压力冻干以缩短冻干时间，并认为这是由于通过改变干燥室内压力可提高干燥层的平均有效导热系数。在循环压力前半周期提高压力以增加气体的导热，提高升华面的温度及相应的压力；在后半周期，降低冻干室内压力，给水蒸汽的逸出提供良好条件；并认为通过选择适当的高低压以及高低压循环的时间，与常压冻干相比可以缩短三分之一左右的时间。Litchfield[51，52]对循环压力冻干从数值计算和实验方面进行了研究，认为从经济性和从冻干时间来讲，循环压力冻干不如简单的恒压冻干。对于生物活体或含有活性成分的药品冻干，不推荐采用循环压力冻干[53] ，生物药品的冻干，保证冻干后的生物活性是最重要的。
3.3 冻干保护剂与生物药品贮藏稳定性
冻干保护作用为冻干和储藏过程中，使高分子稳定、不变质。最常用的冻干保护剂有五种类型[3]，如表1所示。对于生物药品冻干保护剂的选择，Carpentert和 Pikal[54]总结了为：（1）冻干保护剂可全部或部分玻璃化；（2）冻干保护剂的玻璃化温度Tg应尽量高。
Crowe [56]认为：为有效的保护生物药物的活性，仅样品在玻璃化温度以下保存是不够的，还有诸多因素影响生物药品贮藏的稳定性。Byeong SC[57]等研究了重组人干扰素接受抗体在不同保护与缓冲溶液中冻干后的玻璃化温度和贮藏稳定性，实验说明：玻璃化温度以下贮藏样品不是样品贮藏稳定性的一个充分条件，而仅仅为一个必要条件。
4 生物蛋白药品冻干过程中变性与防止
生物蛋白类药品冻干过程中，冰晶的形成与生长易造成未冻溶液的浓度、pH值、离子强度的变化，这些参数的变化容易引起蛋白质分子的凝聚或结构伸展，这种蛋白质分子间和蛋白质分子本身结构的变化在冻融过程中往往是可逆的，但随后的干燥过程会合使这种变化变成不可逆，从而造成蛋白药品冻干后变性、失活[87]。另外，蛋白药品的热稳定性差，冻干保护剂和冻干工艺对冻干蛋白药品的贮藏稳定性有较大的影响，如何防止蛋白类药品活性损失及提高产品的贮藏稳定性是一个极其复杂的问题。
Jensen[15]和Teeter[16]利用X射线衍射研究了蛋白质晶体的内部和表面邻近水分子结构。Jensen 通过对红素氧还蛋白(rubredoxin)晶体衍射照片，计算了电子密集排布，发现在蛋白质表面60纳米以内排列的水分子形成了一层膜，在蛋白质供体和授体处的水分子的密集程度远大于仅由水氢键所形成的水分子密度。60纳米以外，水分子的排列变的开始混乱，直至无序。蛋白质内部也有水分子，且蛋白质内水分子结合力比蛋白质表面的水分子结合力要强的多。Teeter 用一种疏水蛋白质crambin(MW4700)研究了低温下水分子的结构与形态，研究表明，在-143℃时，水分子存在两种网状结构，一种是五边形环状结构，另一种为链状结构，蛋白质分子表面结构对水分子结构与稳定性存在较大的影响。Hagemann et al.[17]计算了重组的牛生长激素吸收等温线，发现在100g蛋白质中有5-8克的水，这些水不仅存在于蛋白质分子的外部，还存在于分子的内部。
Carpenter et al.[18]通过对磷酸果糖激酶（PFK）的研究发现：在冷冻过程中，能使蛋白质变性程度小的赋形剂与蛋白质排斥力要比聚合力大，3mol/L的氯化钠溶液使PFK的活性失稳80%，然而1mol/L的聚乙烯乙二醇溶液能完全保持PFK的活性；在冻干过程中和干燥状态下，只要能取代水分子并与蛋白质分子形成氢键的碳水化合物，就能较好的保护蛋白质活性，把0.6mmol/L的硫化锌加入如50mmol/L的海藻糖溶液的CPA（冻干保护剂）中，PFK的活性就完全稳定了。
关于在冻干过程中蛋白质变性的一种学说为“界面变性”假说。假说认为[19]：药品中蛋白的变化程度与冰晶与蛋白分子接触的界面总面积有关。接触界面积越大，蛋白药品在冻干过程中活性损失越大。用“界面变性”假说可以解释以下几个关于蛋白质冻干中常见的现象。
（1）快速冻结大多对蛋白类药品冻干不利，是因为快速冻结过程中，冰晶与冻结浓缩的溶液间界面面积增大，使变性蛋白质量增大。
（2）低温回火常有利于蛋白类药品的冻干，是因为低温回火促使冰晶生长，冰界面面积减小。
（3）冻干过程中浓度较高的蛋白溶液冻干后稳定性相对较好，是因冰界面处蛋白处于饱和状态。蛋白结构链伸展较少。
（4）表面活性剂有利于蛋白类品药的冻干，是因为表面活性剂占据了冰界面处蛋白的位置，减少了冰晶与蛋白间的界面面积。
Steve Nail[20]等研究了乳酸脱氢酶冷冻干燥工艺。研究发现：冻结过程中的过冷度对的大小对蛋白类样品冻干活率有较大的影响，过冷度越大，活率越小；蔗糖有助于乳酸脱氢酶冻干后活性的提高，仅甘氨酸做保护剂不利于乳酸脱氢酶冻干后活性的提高，但蔗糖和甘氨酸以适当比例组成的二元保护剂对乳酸脱氢酶冻干后活性有相对较好的保护效果，甘氨酸的加入主要可以提高样品冻干过程中的塌陷温度，在冻干样品贮藏过程中有效抑制蔗糖的结晶现象，使冻干样品稳定性更好，甚至样品可贮藏在样品玻璃化温度以上；表面活性剂如吐温80或人血清蛋白的加入，有利于乳酸脱氢酶冻干后活性的提高，表面活性剂添加的量不必要太多，尤其对于吐温80，添加量过多反而不利于乳酸脱氢酶的冻干。Steve Nail等的研究结果支持了“界面变性”假说。
Carpenter [21]用红外光谱研究表明：除了在蛋白质中和碳氢化合物之间的氢键之外，碳键在冻干和重组中对蛋白质的稳定也起重要作用。Prestrelski [22]通过红外光谱研究了不同pH和不同的保护剂对白细胞介素-2（IL-2）冻干贮藏稳定性的影响。研究表明：在无赋形剂存在状态下，pH值极大程度的影响着产品干燥的完成，在pH 为7时，IL-2分子结构是伸展的，而在pH值5以下，IL-2才能保持它天然结构。IL-2在pH 5下要比在pH 7下稳定的多，当考虑可溶性和不可溶的聚合物数量时，二者存在一个数量级的差别，在保护剂存在的条件下，pH对IL-2稳定性的影响与无保护剂存在时相似。保护剂可改变了药品整体的稳定性，在干燥过程中能取代水位置的保护剂，就能最大程度的保护IL-2本来的分子结构，具有较高玻璃化转变温度的保护剂使冻干药品具有较高的储藏稳定性，但有高玻璃化转变温度的保护剂在干燥过程中不一定能阻止蛋白质分子结构伸展。
5 结束语
生物蛋白类药品是近代生物工程制剂的主要产品，蛋白类药品热稳定性较差，溶液状态下极易发生聚合变性，且极易受到微生物的污染，易氧化，大多生物蛋白药品需冻干保存。但生物药品冻干是一个极其复杂的工艺，对其中诸多问题尚无统一的认识，对任何一种生物制剂冻干工艺的探索都是一项极为重要的工作。
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