由于皂苷的亲水性较大，与杂质分离困难，对于结构相近的皂苷用以上方法很难得到较好的分离效果，因此常用色谱方法作进一步的分离。
1．吸附色谱法常用的吸附剂是硅胶、氧化铝和反相硅胶，洗脱剂一般采用混合溶剂。例如分离混合甾体皂苷元的方法，先将样品溶于含2％三氯甲烷的苯中，上柱后用此溶剂洗出单羟基皂苷元，再用含20％三氯甲烷的苯洗出单羟基且具酮基的皂苷元，最后用含10％甲醇的苯洗出双羟基的皂苷元。
2．分配色谱法 由于皂苷极性较大，可采用分配色谱法进行分离。一般用低活性的氧化铝或硅胶作吸附剂，用不同比例的三氯甲烷一甲醇一水或其他极性较大的有机溶剂进行梯度洗脱。
3．高效液相色谱法一般使用反相色谱法，以乙腈一水或甲醇一水为流动相分离和纯化皂苷可得到良好的效果。也可将极性较大的皂苷做成衍生物后用正相柱进行分离。
除此之外，还有一些方法应用于精制与分离皂苷类化合物，如分段沉淀法、胆甾醇沉淀法、铅盐沉淀法、大孔吸附树脂法及液滴逆流色谱法等。