基因治疗（3）

 e marrow cells)with the vector virus in two different ways: they mix them with helper cells producing the virus, or they bathe them in fluid harvested from the helper cell culture.When the vector provirus is integrated into the target cell DNA ,enzymes from the target cell treat it as an integral part of the genome. Cellular enzymes do the work necessary to make proteins from the foreign genes located between the two viral L TRs.

　　非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体，一些具有受体功能的载体也呈现出诱人的前景，关于常见载体的优缺点列于表2。

表23－2　常见基因转运载体的优缺点
 载体 优点 缺点 逆转录病素毒 基因组小并且简单
可稳定整合于宿主基因组

　　生物学特性清楚

　　可高效转入复制中的细胞

　　对宿主细胞无害 仅感染分裂细胞

随机整合（可能导致突变）

　　常常只有短暂表达

　　病毒滴度低（107pfu/ml）

　　可能会与有复制能务的病毒重组插入容量有限（10kb） 腺相关病毒 基因组小（5kb）

可特异整合于人19号染色体

　　以人细胞作为宿主

　　无毒、无致病性 尚未研究清楚

需腺病毒辅助复制

　　携带外源基因能力有限（4kb）

　　难得到高滴度病毒 腺病毒 适于原位使用，尤其是肺

(在不分裂细胞中可进行高效率的体内感染)

　　病毒滴度高（1010pfu/ml）

　　生物学特性清楚 不与宿主基因组整合(只有短暂表达)

载本基因组复杂

　　病毒蛋白可能引起免疫反应及炎症反应

　　插入外源基因能力有限（7-8kb） 脂质体 无感染能力

理论上无DNA大小限制

　　毒性低 无特异性靶细胞

转染效率低

　　仅有短暂表达

　　体内应用困难 受体介导的转运 无感染能力

特异性转染靶细胞

　　理论上无DNA大小限制

　　构建灵活 转染效率低

体内应用困难

　　可能有免疫原性

　　只有短暂表达

　　（三）靶细胞的选择

　　理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞，用于转基因的体细胞必须取材方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用中应具体根据目的条件选择。

　　（四）细胞转染（tansfection）

　　将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染法四类。病毒法已在本节的“基因的转运”中有基因介绍。目前较多使用的是脂质体法。

表23-3 DNA导入哺乳动物细胞常见的方法
 名称 机制 转染效率 用途 优缺点 影响因素 磷酸钙转染法 内吞作用 20%细胞被转染 瞬时表达 1、简单有效
2、适用于贴壁、非贴壁细胞

　　3、常作首选方法 1、Ca2+，DNA浓度

2、PH值，沉淀反应时间

　　3、氯喹，甘油和丁酸钠处理 DEAE葡聚糖转染法 抑制核酸酶

内吞作用 在BDC-1，CV-1和COS细胞中较高 瞬时表达 操作简单 1、需高浓度DNa

2、DEAE葡聚糖浓度

　　3、温育时间 Poly-brene转染法 不清楚 低分子量DNA转染率高于磷酸钙法 CHO细胞的稳定转化子 能得到较多的稳定转化子 1、受体细胞类型

2、转染调控信号

　　3、DNA浓度 原生质体融合 胞膜融合 50-100%转染，稳定子得率为0.2-0.02% 瞬时表达

稳定表达 1、操作复杂

2、不能进行共转染

　　3、慎用于筛选营养缺陷型变异株 1、溶菌酶、PEG浓度

2、温育时间 电穿孔 高压在膜上形成微孔 效率较高 瞬时表达

稳定转化 1、需精密仪器

2、可用于动物、植物细胞和细菌1、电场强度

2、脉冲长度

　　3、温度，DNA浓度

　　4、培养液 脂质体 脂膜融合 50-60%转染 瞬时表达

稳定转化 1、操作简单

2、可用于体内试验 1、脂质体质量

2、DNA浓度 胞核微注射法 直接注射 50-100%转染 稳定转化 1、需要特殊仪器

2、处理样品数量少

　　3、高效 1、注射技术

2、DNA浓度

　　在目前的技术状态下，一般而言其基因转染效率很难达到100%。故必须首先将转导细胞和未转导细胞加以区分。这方面的新技术发展很快，常用的转导细胞筛选方法有：

　　利用基因表达产物筛选法：（1）标记基因筛选法：在载体上引入一个标记基因，或同时导入标记基因，在转染后的适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛选标记基因表型，那些已导入外源基因的细胞将存活下来，而未转录的细胞则死于选择性细胞培养基。如在较多的载体中都有neor标记基因存在，若向培养基中加入G418进行选择，最后只有转导细胞存活下来。（2）基因缺陷型受体细胞的选择性：以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选择性培养基进行筛选。例如将TK基因导入TK-的靶细胞，转录细胞可在HAT培养基中生长，未转导的细胞则不能在HAT培养基中生长。（3）基因共转染技术：将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因和目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后得到复合转导的转化子。

　　分子生物学方法：外源基因是否真的转入靶细胞必须用分子杂交方法进行证实。常用的方法有原位杂效，Southern杂交和打点杂交。其中主要问题是探针的选择。若靶细胞内原来不存在所转入的目的基因，可选用目的基因作为探针；靶细胞内一般无标记基因存在，故标记基因是良好的探针。探针大小可以是较大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA单链探针分子。PCR方法目前也已用于转导细胞的鉴定，且该法相对简单易行。

　　（五）外源基因的表达及检测

　　在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，NRA打点杂交，免疫组织化学染色等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外源基因的表达状况。

　　一些影响基因表达的因素如表4所示。

表23-4 调节重组细胞表达系统的DNA控制元件
 启动子
病毒启动子：如LTRS，CM