基因治疗（2）

--使传染源失活（反义技术、核酶、核酸陷井） 其它疾病 --导入药物基因（药物释放）如激素、细胞因子

--失活有害基因产物（反义技术、核酶、核酸陷井）

　　--杀伤策略如减少特异细胞群

　　二、 基因治疗的基本程序

　　基因治疗是在基因工程基础上发展起来的分子生物学技术，它相对于现有其它治疗方法较为复杂。基因治疗的基本过程包括以下主要方面：

　　（一）目的基因的选择和制备

　　基因治疗的首要问题是选择用于治疗疾病的目的基因。对遗传病而言只要已经研究清楚某种疾病的发生是由于某个基因的异常所引起的，其野生型基因就可被用于基因治疗，如用ADA基因治疗ADA缺陷病。但在现在的条件下，仅此是不够的。可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过高表达不会对机体造成危害。很显然某些激素类基因如与血糖浓度相关的胰岛素基因目前尚不能用于糖尿病的基因治疗。在抗病毒和病原体的基因治疗中。所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史和起重要的作用并且该序列是特异的，如针对HBV的HBeAg或X基因等。肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体，肿瘤细胞内往往存在多种基因异常形式，可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生簪，所针对的癌基因或抑癌基因应下该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。

　　在确定欲选目的基因后，就在制备目的基因。正向表达的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是基因组DNA(genomic DNA)片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)等新技术进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备。

　　（二）基因的转运

　　目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。

　　病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒。疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转录病毒用作载体时需进行几步改造：（1）将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因，如图23-2所示。（2）制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能，如图23-3所示。（3）将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。如图23-4。（4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达，如图23-5所示。

STEP 1

INSERTING FOREIGN DNA INTO THE RETROVIRAL PROVIRUS

Wild-Type Provirus

图23-2 Scientists use recombinant DNA techniques to replace the gag,pol,and env genes with one or more foreign genes.The foreign genes can be inserted in several different patterns.in this example,a selectable marker gene(neo)replaces the viral gag and pol genes and　a human gene replaces the env gene.

STEP 2

MAKING THE HELPER CELL

Desiging the Helper Vius

图 23-3 The helper cell should meet two basic requirements:(1)it should provide functions missing from the the vector virus,and(2)it should not be capable of producing viable virus particles. The crucial element in the development of a successful helper cell is the design of the helper virus.Researchers use recombinant DNA techniques to disable the helper virus in the test tube-one of the most common measures is removal of the Psi fragment.The Psi-deficient helper virus produces all of the normal viral proteins, but cannot package its own RNA because it lacks the  appropriatepackaging signal. Helper virus DNA is inserted into the genome of the helper cell using chemical techniques.

STEP 3

PRODUCING THE VECTOR

图23-4 Scientists use chemical measures or an infection technique to insert recombinant vector DNA (including a human gene) into helper cells.Because the vector provirus contains the Psi sequence, the vector RNA genome is automatically encapsulated by viral proteins produced by helper virus DNA in the helper cell. The resulting viral particles are released by budding from the helper cell membrane. The vector virus is capable of only one infection because it lacks the information needed to make viral proteins.

STEP 4

INFECTING THE TARGET ELL

图23-5 Researchers infect target cells (such as human bon