基因工程载体（2）

 基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。

　　利用λ噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的λ噬菌体载体也是已作过许多人工改造的，主要的改造是：①设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。这是因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。②在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ’序列，和多克隆位点等。由此可构建出两类λ噬菌体作载体；一类是插入型载体，可将外来序列插中段，常用的λgt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA；另一类是转换型载体，即可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。

图20-4　野生型λ噬菌体DNA及相应的λ噬菌体DNA图谱

　　插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的，当噬菌体DNA长度大于野生型λ噬菌体基因组105%或小于78%时，包装而成的噬菌体存活力显著下降。所以λ噬菌体载体可插入长5-20kb的外来DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。

　　如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。

　　三、动物病毒载体

　　质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等（见后）。

　　人基因组十分庞大，约含4×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要