寄生虫学实验技术(6)

  (七)酶联免疫吸附试验

    酶联免疫吸附试验(enzyme-linked  immunosorbent  assay.ELISA)简称酶联试验，已广泛用于多种寄生虫感染的宿主体液(血清，脑脊液等)以及排泄分泌物(尿，乳，粪便等)内特异抗体或抗原微粒的检测。根据检测要求，试验可分多种类型，常用者有：用于检测抗体的间接法；检测IgM的双夹心法；检测抗原的双抗体夹心法；以固相抗体检测抗原的竞争法以及竞争抑制法等(图22-8)。

 

图22-8  酶联免疫吸附试验常用方法示意图

    酶联试验的方法根据所用载体、酶底物系统、观察反应结果等不同而有很大差别。目前最常用的固相载体为聚苯乙稀微量滴定板，具有需样少，敏感，重演性好，使用方便等优点。酶底物系统也有多种，常用的有辣根过氧化物酶-邻苯二胺(HRP-OPD)、碱性磷酸酯酶-硝酚磷酸盐(AKP-PNP)等，具有较好的生物放大效应。其中HRP由于价廉、易得而被广泛应用。

    酶联试验的基本操作过程可分为：①固相包被；②温育洗涤；③加样；④酶结合物反应；⑤底物显色；⑥终止反应读取结果等若干步骤。温育和洗涤需贯穿在每二步骤之间，用以去除多余的反应物。以下为临床上最常用的间接法(检测抗体)和双抗体夹心法(检测抗原)的操作程序：

    ⑴间接法：

    1)以包被液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液0.05mol/L，pH9.6)稀释抗原(常用5～10µg/ml)，每孔0.1(或0.2)ml包被反应板，37℃湿盒温育2～3小时或4℃过夜；
    2)弃去包被液，反应板用去离子水或PBS-Tween液(0.005mol/L PBS含0.05%Tween-20)冲洗3次，甩干；
    3)用样本稀释液(0.05mol/L PBS含0.05%Tween-20)稀释样本(起始浓度≥100-1)，用样本稀释液(每孔0.1(或0.2)ml，温育1小时；
    4)弃去样液，如上冲洗，甩干加稀释结合物(市售品常稀释至100-1，用样本稀释液)，每孔0.1(或0.2)ml，温育1～2小时；
    5)如上冲洗甩干后即刻加入新鲜配制的底物系统，每孔0.1(或0.2)ml，置暗盒室温15分钟；
    6)终止反应：HRP-OPD系统每孔加1mol/LH2SO450µl；
    7)目测或用分光光度计在400µm波段测定吸收值来判断。

    ⑵双抗体夹心法：

    1)以包被液稀释抗体(如兔抗血吸虫虫卵可溶性抗原的抗体，抗SEA-IgG)包被反应板(1～1000µg/ml)，方法同间接法包被抗原；
    2)冲洗，甩干，加样温育同前(起始浓度≥5-1)；
    3)加结合物(例如抗SEA-IgG-HRP)，适宜工作浓度需先经方阵滴定确定；
    4)以下各步同间接法。

    若包被抗体与第二抗体来自不同种的供体则可应用市售抗免疫球蛋白结合物。例如包被抗体为羊抗SEA，二抗用兔抗SEA则在未标记的二抗温育洗涤后加羊抗兔IgG结合物(GAP-HRP)。

    [附]酶标记物制备：应用抗原或抗体与酶分子的交联技术，交联物亦称酶结合物(conjugate)。根据酶与抗体(抗原)的激活顺序，交联反应可分一步法、二步法及三步法不等。其中以二步法中的过碘酸钠法多用，戊二醛一步法反应率较低，较适用于交联AKP。免疫球蛋白标记辣根过氧化物酶(过碘酸钠法)与免疫球蛋白标记碱性磷酸脂酶(戊二醛一步法)，按常规方法制备。

    抗IgG型抗体酶结合物也可用金黄色葡萄球菌A-蛋白酶结合物替代，称A-蛋白酶联试验(SPA-ELISA)。A-蛋白辣根过氧化物酶结合物(PA-HRP)已有市售标准品，其敏感度稍逊于抗体酶结合物。

    底物配制：不同的酶要求选择相应底物，以下为分别适用于比色和肉眼读取结果的两种HRP常用底物配制。

    邻苯二胺(OPD)：经HRP催化后生成橘红色产物。40mgOPD溶于柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)100ml(含24.3ml 0.1mol/L柠檬酸，25.7ml0.02mol/L Na2HPO4加水50ml)，临用前加30%H2O20.15ml，温育15分钟后用2mol/L H2SO4终止反应，492nm读数。本底物具高度敏感性，显色梯度良好，生成可溶性产物，有利于比色读数，但为光敏感，反应时应置暗盒内；也具致突变作用。

    5-氨基水杨酸(5AS)：经HRP催化生成棕色产物。8mg5AS溶于10ml50℃温热蒸馏水中，置4℃暗处不超过3天，临用前以1N NaOH调pH至6.0，加0.05%H2O2 1ml。37℃经30～60分钟温浴后用1N NaOH终止反应，肉眼或449nm比色。本底物无致突变作用，生成棕褐色不全溶解的产物有利于肉眼判读结果。

    酶联试验为高灵敏检测技术，结果可定量表示，可检测抗体、抗原或特异性免疫复合物，微量滴定板法消耗样本试剂少，能供全自动操作，适用批量样本检测，因此在寄生虫感染的研究和诊断领域乃至血清流行病学均被广泛应用。国内外有多种寄生虫感染的酶联药籍出售，包括有血吸虫病、弓形虫病、阿米巴病、丝虫病、蛔虫病、旋毛虫病和犬蛔虫病等，ELISA可用作辅助诊断病人，血清流行病学调查和监测疫情的方法。酶联试验操作程序的简单快速不如IHA，但方法具有很大所改良潜力和适应范围。判断结果需用分光光度计，限制了扩大应用；另外，应用抗原及酶结合物尚需进一步标准化，操作方法也应规范化。

    近年来已有多种改进的酶联免疫吸附试验如①快速-ELISA：改进特点为用PVC薄膜代替聚苯乙烯微量反应板作载体；将1%可溶性血吸虫卵抗原与尿素溶解性血吸虫卵抗原等量相混合预吸附于薄膜上；用抗人IgG McAb代替羊抗人IgG制备酶结合物；用底物TMB代替OPD。该法主要以目视法判断结果，整个操作流程仅需20min左右。②硫酸铵沉淀抗原-ELISA：可溶性血吸虫卵抗原经饱和硫酸铵沉淀后用作ELISA诊断抗原；在系列实验基础上，使操作方法达到规范化；用质量控制图控制检测差异，并以标准曲线单位判断结果；缩短检测时间，节省检测时间，节省试液用量，提高了敏感性，特异性和重现性。

    (八)斑点ELISA

    斑点ELISA(dot-ELISA)是近年新发展的一种ELISA技术，选用对蛋白质有很强吸附能力的硝酸纤维素薄膜作固相载体，底物经酶促反应后形成有色沉淀物使薄膜着色，然后目测或用光密度扫描仪定量。dot-ELISA可用来检测抗体，也可用来检测抗原，由于该法检测抗原时操作较其他免疫学试验简便，故目前多用于抗原检测。

    操作方法将待检血清作1:1～1:20稀释，用微量加样器将1µl血清点滴于硝酸纤维素膜(NC)上，置于70℃经1h，将NC浸于1%BSA-PBS中，室温摇荡1小时，洗涤2次，加1：1000稀释的McAb酶标记物，室温摇荡2小时，洗涤3次后，加底物3，3'二氨基联苯胺或4氯-1-乙萘酚，15分钟后，流水终止反应，以目视法判断结果。凡显示棕色斑点者为阳性，否则为阴性。以产生棕色斑点反应的最高稀释度为抗原滴度。

    该法简易，快速，适合于现场应用，有广阔的应用前景。现有的资料初步证明具有诊断病人和考核治疗效果，国内已用于血吸虫病，疟疾，丝虫病，棘球蚴病的诊断。国内学者曾比较斑点ELISA和双抗体夹心ELISA用于检测班氏丝虫病人循环抗原。采用相同的单克隆抗体和病人血清进行两种方法对比试验。结果显示两种方法检测的特异性均大于95%，但是它们的敏感性有明显不同，斑点ELISA能检测出血清中0.055ng/ml微丝蚴抗原，而双抗体夹心ELISA仅能测出≥10ng/ml抗原；并且前者不需要特殊的设备，适用于丝虫病流行区。另有报告用单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AsT)检测血清抗原诊断黑热病，效果较为满意，方法上进一步简化，加样以原浓度血清反应，效果最佳。国外还用于旋毛虫病、丝虫病、弓形虫病以及肺孢子虫病的血清学诊断方法。

    (九)免疫酶染色试验

    免疫酶染色试验(immunoenzymic  staining  test，IEST)是以含寄生虫病原的组织切片，印片或培养物涂片用作抗原进行过氧化物酶特异免疫染色后在光镜下检示样本中的特异性抗体。在蠕虫和原虫感染中均有多种应用。

    操作过程抗原组织作冰冻(5～10µm)或石蜡连续切片(4～8µm)排列于载玻片，经丙酮固定贮存于-20℃备用。原虫纯培养亦可制成分隔涂片，方法均同荧光染色法抗原制片。试验时先将抗原片在稀释的过氧化氢溶液浸泡15分钟，除去可能存在于组织中的内源性过氧化物酶；抗原片用PBS冲洗后经Tris缓冲液(PBS，pH7.6)10倍稀释的正常兔或羊血清培育10分钟，迅速以PBS洗涤后加检测样本(单个或系列稀释度)，置湿盒室温(20～25℃)或37℃培育30分钟；PBS洗涤3次，每次5分钟，然后加兔或羊抗人过氧化物酶结合物(参照ELISA法)，结合物中可加入所用抗原组织片供体动物血清约1/25～1/3体积，用以阻断可能交叉反应，降低背景色度；抗原片以PBS洗涤3次后加联苯胺(DAB)底物溶液(饱和联苯胺液加等量pH7.6硼酸缓冲液，用前按9:1体积加入0.1%H2O2液)，室温显色10～15分钟后在光镜下观察反应结果。

    反应标准：“-”，组织内抗原部位不呈现棕红色；“+”，组织内抗原部位(如血吸虫肝卵切片中的虫卵)呈现棕红色；“++”，局部呈现清晰的棕红色；“+++”，呈现非常清晰的棕红色。

    该法简单，节省抗原；判断结果不需要特殊仪器；适合于现场应用。IEST可用作辅助诊断病人，考核疗效，血清流行病学调查及监测疫情的方法。目前主要应用于血吸虫病、丝虫病及囊虫病诊断，也可用来诊断华支囊吸虫病、肺吸虫病、包虫病和弓形虫病。

    目前对该方法改进有：①用感染鼠肝组织内虫卵制成7µm厚度冰冻切片(或石蜡切片)作为诊断用固相抗原代替可溶性血吸虫卵抗原作IEST，具有取材容易和应用抗原经济的优点。②将冰冻切片置于载玻片上，可以反复使用载玻片，较一次性用的PVC薄膜/苯氯乙烯反应板价廉，显著地降低了检测费用。③判断结果时，应用普通光镜即可。染色标本不必即时检查。可保存很长时间，便于复查。④阳性血清作最高滴度，可定量抗体水平，用作考核疗效有及防治效果的指标。⑤IEST的反应基本原理与COPT相似，但前者应用切片虫卵代替了COPT的整个干卵，前法的反应快速(约1.5～2小时)而后法较缓慢(需48～72小时)。为此，IEST弥补了COPT诊断时，漏检病人和取得结果不快速的缺陷。病鼠肝组织内虫卵冰冻切片抗原IEST，目前已在疫区扩大应用。现已研制成试剂盒，批量生产，供应现场需用。

    (十)免疫印渍试验

    免疫印渍试验(immunoblot或Western  blot)是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳转印及标记免疫试验三项技术结合而成的一种新型的免疫探针技术(immuno-probing   technique)，是用于分析蛋白抗原和鉴别生物学活性抗原组分的有效方法，近年已应用于检测寄生虫感染宿主体液内针对某分子量抗原的相应循环抗体成分或谱型。是为一项高敏感和高特异的诊断方法，具有很大发展潜力。用于诊断的免疫印渍试验以采用酶标记的探针(即二抗及其标记结合物)为安全方便，称酶免疫转移印渍试验(enzyme   immuno-transfer  blotting，EITB)。

    1.操作程序(以血吸虫EITB为例)

    ⑴样本分离：

    1)取日本血吸虫新鲜成虫按5～10对/1.5ml比例加样本缓冲液，匀浆，置沸水浴2分钟，离心(10000g，30分钟)，取上清液备用。
    2)上述成虫抗原样本进行单梳SDS-PAGE电泳分离。左侧梳孔加标准分子量蛋白，梳孔右侧样槽加抗原液，电压控制在160～180V之间。

    ⑵电泳转印：

    1)从电泳板中取出已完成电泳的凝胶片浸泡于盛有转印缓冲液(TB)的搪瓷盘 内。
    2)在TB液内组成转印夹心板层：取相应大小的硝酸纤维(NC)薄膜，徐徐浸泡在TB液，将凝胶片与薄膜光面紧贴。两面各放置浸湿滤纸两层而后海绵垫(厚0.5～1cm)一层，做好方位标记，最后夹于二层有孔塑料衬板之间，绝对避免各层之间留有气泡。
    3)将TB倒入转印槽中，然后插入转印板，使凝胶片位于阴极侧，NC薄膜位于阳极侧。
    4)置转印槽于4℃冰箱内，通电转印数小时或过夜，电流控制在250mA上下(约40～50V)。

    ⑶探针检测：

    1)取出转印好的NC薄膜，水平地放入猝灭剂中，室温摇动1小时以封闭未吸附蛋白质的区域，然后用洗涤缓冲液选2～3次，每次30分钟以除去亦性剂，使蛋白质的天然状态和生物学特性得以恢复。
    2)平置NC薄膜于浸有Tris-缓冲盐水(TBS)的滤纸上，用刀片将薄膜按电泳方向分割为宽约0.5cm的直条，用铅笔做好上端标记。
    3)取其中一个细条，并同标准蛋白条带一起作氨基黑染色(也可用考马斯亮蓝染或银染)测试分离效果并确定分子量位置。其余细条晾干后置4℃作印渍试验备用(抗原活性可保持3个月以上)。

    ⑷印渍试验：

    1)置上述抗原条于分格反应板的反应槽内，正面向上，每槽一条，预先用0.05%TBS-Tween液浸湿(TBS-T)；
    2)被检血清用TBS-T液稀释(常用1:150)，加入反应槽中，以浸没膜条为限。通常需0.5～1.5ml，相当于10µl血样量(每槽加液量下同)；
    3)室温(20～25℃)振荡60分钟，以后用TBS-T洗6次，每次3分钟；
    4)加已稀释的羊抗人酶结合物，温育1.5小时，洗涤如上；
    5)加入新鲜配制的底物溶液(TBS50ml+0.3%萘酚甲醇液3ml+30%H2O210µl；或二氨基联苯胺，DAB，5mg/ml 0.05mol/L柠檬酸磷酸缓冲液，pH5.0，每60ml加3%H2O220ul和1%COCl20.2ul 和1%COC120.6ml)；
    6)15分钟后用蒸馏水冲洗数次以终止反应，薄膜条取出置玻板自然干燥；
    7)阳性反应可见蓝黑色(4氯1萘酚底物)或棕褐色(DAB)条带。

    2.主要试剂

    ⑴样本缓冲液：含甘油10ml，2-巯基乙醇5ml，10%SDS30ml。
    ⑵转印缓冲液(TB)：Tris 3g，甘氨酸14g，甲醇250ml，水加至1000ml。
    ⑶Tris缓冲盐水(TBS)：10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1调pH至7.4。
    ⑷TBS-T液：TBS液内含0.05%Tween-20于TBS液。
    ⑸猝灭剂：1%～5%BSA或0.1%～0.3%Tween-20于TBS液。
    ⑹氨基黑染液：0.1%W/V氨基黑(C. I. 20470)，45%V/V甲醇，10%V/V冰醋酸。

    脱色液：90%V/V甲醇，2%冰醋酸。

    EITB用作鉴定寄生虫抗原的特定组分蛋白及诊断寄生虫病的方法。在国外已成功地用于艾滋病的常规诊断，并且在疟原虫、弓形虫、血吸虫、肺吸虫、包虫等的研究分析方面有很多报道。国内用于检测包虫病患者血清抗体也获良好结果，初步应用于血吸虫感染现场调查，用上述抗原及操作程序可检示特异的抗肠相关31/32kD诊断蛋白抗体的条带，呈现特异和敏感的特性。用本法对感染宿主不同病期抗体谱型的研究，可望获得有效化疗后早期隐退的特异条带。批量制备抗原分离的薄膜条带，有可能成为适用于现场查病的特异性诊断药盒，不铁为一项具有诊断潜能的新技术。

    (十一)杂交瘤技术制备单克隆抗体

    经十多年的研究，单克隆抗体(McAb)广泛用于寄生虫病临床与实验研究。如寄生虫虫种与虫株的分型和鉴定；建立以检测循环抗原为主的免疫诊断方法；分析和纯化抗原制备靶抗原；以及寄生虫感染免疫，保护性免疫和虫苗制备等方面，目前，国内外有报告，McAb用于疟疾、弓形虫病、血吸虫病、肺吸虫病、棘球蚴病、丝虫病等方面。有关McAb在疟疾中的应用，如对虫种，虫株的鉴定与分型，通过采用McAb对环孢蛋白(circumsporozoite   protein，CSP)抗原及裂殖体糖蛋白研究，为疟原虫分型鉴定提供了新的依据；单克隆抗体的应用又为提高临床免疫诊断价值提供了极好的工具，近年来，国内已有报告采用McAb双夹心斑点金银染色法和双夹心斑点酶联免疫吸附试验以检测疟原虫循环抗原，阳性率分别达90%～93.3%和85%～86.7%，具有较高的特异性和重复性，另外发现某些抗子孢子、裂殖体(子)和配子体的单克隆抗体具有保护作用。保护性McAb的发现不仅为制备虫苗的靶抗原提供了条件，而且为进行被动免疫开辟了途径。

    在血吸虫病方面，单克隆抗体已应用于血吸虫抗原分析，免疫学诊断和保护性免疫研究，国内外均已报道采用检测血吸虫循环抗原，如Sj23，Sm38，Sj70等抗原，其阳性率在90%～97%，交叉反应低且有良好的疗效考核价值，有关保护性免疫研究方面，主要集中在分子量分别为28kD和38kD的抗原，现有资料初步表明以McAb提纯的28kD抗原免疫大白鼠后，可获得70%的保护率。

    在丝虫病方面，应用杂交瘤技术已制备出识别马来微丝蚴表面分子量分别为70kD、75kD、110kD等抗原的McAb，某些McAb能介导巨噬细胞粘附于微丝蚴表面，引起虫体死亡。将这些McAb被动转移给受体动物，在体内能降低微丝蚴血症。

    (十二)DNA探针技术

    DNA技术(probe)技术，又称核酸分子杂交(molecular   hybridization)技术，最近几年迅速发展起来的一种敏感性高，特异性强，应用面广的研究手段。在寄生虫病诊断中，探针是病原体的特异核酸序列，可用来检测出病原体是否存在，其关键环节在于获得特异的核酸探针。近10年来应用特异的核酸探针鉴定寄生虫和诊断寄生虫病的研究报道较多，现有资料表明，DNA探针检测，其特异性和敏感性高；并且DNA探针是直接检测寄生虫的基因，故比血清学方法可靠；又因探针DNA较稳定，在合适条件下可较长期保存；在试验条件不变时试验结果的重演性较好。在寄生虫病的诊断、现场调查、寄生虫种的鉴定及分类等方面的研究中均已使用了DNA探针技术，内容包括原虫、吸虫、线虫、绦虫、昆虫的鉴定和致病的诊断。另外，核酸探针已成功地用于许多传播媒介体内寄生虫的鉴定。但是一般尚在实验阶段。可望能用作高效和准确的寄生虫病血清学方法，用以制备经济和理想的诊断抗原。

    (十三)PCR技术

    检测病原体遗传物质用以诊断寄生虫病的方法，除分子杂交技术外，新近发展的更灵敏、快速，并且不需要同位素标记的基因扩增技术，如聚合酶链反应(polymerase   chain  reaction，PCR)是一种体外扩增特异性DNA技术。

    现已使用PCR技术于寄生虫病诊断，如锥虫病、利什曼病、肺孢子虫病、肠球虫病、贾第虫病、弓形虫病等，在一些疾病中，有时原虫数量极少，用一般方法无法检测，经用PCR扩增DNA模板，提供了一条解决诊断的途径。如在检测锥虫时，PCR扩增纯化DNA可使探针检测到血样中1个虫体；国内建立了弓形虫病PCR诊断方法，具有高度特异、敏感且快速的优点。今后在寄生虫学领域中将会更广泛深入地开展PCR技术的应用。

    第二节 寄生虫人工培养

    本书仅介绍三种原虫的人工培养。

    一、溶组织内阿米巴培养。

    1.营养琼脂双相培养基

    ⑴固体部分：牛肉浸膏3g；蛋白胨5g；琼脂 15g；液体1000ml(见“液体部分”)。
    ⑵液体部分：氯化钠8g；氯化钾0.2g；氯化钙0.2g；氯化镁0.01g；磷酸氢二钠2g；磷酸二氢钾0.3g；蒸馏水1000ml。

    制备先配液体部分2000ml，氯化钙与氯化镁另装小瓶，高压灭菌(压力6.81公斤20分钟)后冷却，合并一起，取1000ml配固体部分，经沸水浴2～3小时，使完全溶解。若有残渣可用4层纱布过滤除去，趁热将滤液分装试管，每管5ml，高压灭菌，形成斜面，冷却后放冰箱中备用。接种前，每管加液体部分4.5ml和牛血清0.5ml，并加米粉20mg(用大米粉分装小管，经180℃烤箱消毒3次)。

    2.洛克氏液鸡蛋血清培养基

    ⑴培基成分：洛克氏液70ml；灭活血清(每管加0.5ml)；米粉(每管加20mg)；鸡蛋4个。
    ⑵洛克氏(Locke)液：氯化钠9g；氯化钙0.2g；氯化钾0.4g；碳酸氢钠0.2g；葡萄糖(压力3.63公斤15分钟)2.5g；蒸馏水1000ml。

    制备先配洛克氏液1000ml，取鸡蛋用肥皂水洗刷净，以70%酒精洗净后，破壳将蛋黄、蛋清倾入含70ml洛克氏液的小三角烧瓶内，加有玻璃珠，充分摇动使其内含物混合，之后分装消毒试管内，每管约5ml，置斜位在70℃下经1小时凝固斜面，翌日再置高压消毒20分钟。接种前每管加洛克氏液4.5ml、马血清0.5ml、米粉20mg。

    二、阴道毛滴虫培养

    常用肝-胨-糖培养基的培养方法。

    1.培养基的配制：15%肝浸液100ml；蛋白胨2g；葡萄糖0.5g。

    将以上成分混合，加热使溶，经滤纸过滤，调节pH至5.5～6.0。每管分装5ml，8磅20分钟高压灭菌，冷却后，置37℃恒温箱中24小时，证明无菌后，贮存于冰箱备用。接种前每管加灭能无菌马血清1ml，即可用。

    15%肝浸液的制备：取牛或兔肝15g，洗净，剪碎如小米粒大小，浸入100ml，蒸馏水中，置冰箱过夜，次日煮沸半小时，用4层纱布过滤除去渣滓，补充蒸馏水至100ml，即成15%肝浸液。

    2.培养方法①以无菌棉拭从阴道后穹窿处取分泌物，无菌接种入上述的培养基中；②初次接种和第1、2次转种时，应加青霉素5～10万单位/2ml培基；③培养温度为35～38℃为宜；④pH在5.4～6.8之间。

    第三节 寄生虫实验动物保种

    寄生虫的动物保种，是将其感染期接种于实验动物，使虫体在动物体内存活，以利于寄生虫与寄生虫病的研究、寄生虫病诊断以及制备教学标本等。

    一、杜氏利什曼原虫无鞭毛体

    取患者的前述组织穿刺物，用适量生理盐水稀释后，注射于田鼠(或金黄地鼠)腹腔内，每只鼠注射0.5ml，放笼内饲养。一个月后杀死田鼠，取其肝、脾组织作涂片，染色，镜检。转种时将感染利肝曼原虫的田鼠解剖，取其肝、脾置于消毒的组织研磨器中或研钵中，加入少量生理盐水研磨为匀浆后，再加适量生理盐水稀释，用消毒注射器吸取稀释液注射健康田鼠腹腔内，每只鼠注入0.2～0.5ml，继续饲养。3～4周后，按前述方法进行检查。原虫在动物体内可生存数月。

    二、刚地弓形虫

    经穿刺抽取病人的脑脊液0.5～1ml，注射于体重18～25g的健康小白鼠腹腔内。3周后抽取小白鼠腹腔液作涂片检查(查滋养体)。如为阴性再取肝、脾、脑组织研磨为匀浆，按1:10量加入无菌生理盐水稀释，进行第二次接种。如仍为阴性可用同法进行2～3次，再观察结果。阳性者可作接种传代，每2周一次，以保种。

    接种小鼠，每只注射0.3～0.5ml的匀浆。感染后每天观察，即抽取腹腔液涂片，染色后观察。一般感染第四天可见到弓形虫滋养体。

    抽取病鼠腹腔液方法，是在其腹部作一切口，用镊子夹提腹部的皮肤和腹膜，用1ml注射器吸取1ml生理盐水，迅速注入腹腔，轻揉腹壁，使生理盐水和腹腔液混匀，然后再抽出腹腔液检查。

    三、旋毛虫

    将感染旋毛虫的小白鼠(或大白鼠)杀死，剥皮，取其肌肉；也可取含有幼虫的猪肉，剪成米粒大小，取1小块肉置在载玻片上压片检查，以含有100～200个幼虫囊包量的肌肉，经口喂健康小白鼠，喂前应饥饿小鼠24小时；或将含有幼虫囊包的肌肉剪碎，置于含有消化液的三角瓶内，一般每1g肌肉加入60ml的消化液，置37～40℃温箱中，经10～18小时(此间经常摇动烧瓶或搅拌)，去掉上层液，然后以水洗沉淀法或离心沉淀法收集幼虫。以生理盐水洗涤2～3次，用1ml的注射器和8号针头吸取100～200条幼虫，经腹腔注射或喂饲健康小白鼠(或大白鼠)。感染第5周后，可在鼠肌中(以膈肌、腿部肌多见)可找到幼虫囊包。幼虫在动物体内可生存3个月或半年。

    四、血吸虫

    1.实验动物一般用18～22g体重的健康小白鼠或2～4kg家兔。
    2.尾蚴逸出将阳性钉螺2～3只放入指管(1×7cm)中、加入去氯水或冷开水至管口，管口盖以铜丝网，以防钉螺爬出。置25℃孵育4～12小时，尾蚴可陆续逸出浮于水面。
    3.感染动物将小白鼠或家兔仰卧固定在木板上，剪去腹毛，范围约5×5cm约1～2张盖片大小)，用清水洗净腹部皮肤。用白金耳沾取液面的尾蚴置于盖玻片上，在解剖镜下计算尾蚴数量。通常感染小白鼠每只50条尾蚴，家兔500～800条即可。将含已计数尾蚴的盖片，翻转覆盖在动物腹部的去毛处，使其与皮肤接触，同时在盖片与皮肤之间滴加少许清水，以保持湿润；冬季应保持温度在25℃左右，15～20分钟后取下盖片。感染后约40～45天，即能在动物粪便中查到虫卵。操作中应防止感染，用过器材应消毒。

    五、华支睾吸虫

    常用实验动物有猫、犬、豚鼠、大白鼠、兔等。取含有华支睾吸虫囊蚴的鱼肉，用人工消化液消化后收集纯净的囊蚴。将囊蚴拌入饲料喂食或直接从口内插入橡皮管注入胃内。感染囊蚴的数量，因动物大小而异，以200～400个为宜。感染后一个月，即可自粪便内检获虫卵。

    六、卫氏并殖吸虫

    常用实验动物有犬、猫。将感染该种吸虫囊蚴的溪蟹或蝲蛄，放入清水中洗净后，用研钵或绞肉机捣碎，经筛过滤去除粗壳渣，以沉淀法反复清洗至水清。吸出沉渣放在双筒解剖镜下检查，用滴管吸取囊蚴并计数，将定量囊蚴拌入饲料喂动物。也可将囊蚴放入含有2%胆酸盐溶液中，置40℃1小时，使后尾蚴脱囊。用无菌生理盐水洗涤后，给猫或犬进行腹腔注射。幼虫数量以100～300个为宜。约2个月后可在粪便中检出虫卵。

    注：人工消化液配方

    盐酸 0.4ml
    胃蛋白酶 25g
    蒸馏水100ml  

    第四节 寄生虫标本的保存

    寄生虫标本的保存，除制成玻片标本永久保存外，还可用以下各种保存方法。

    一、原虫包囊和虫卵的保存

    汞碘醛液10ml与粪便1g混匀后密封在瓶内，可保存其中的原虫包囊及虫卵数月之久，也可在经浓集法处理的粪便沉渣中加等量或1倍量的10%甲醛液(加热至70℃)，摇匀，用石蜡封固瓶口。

    二、蠕虫成虫的保存

    1.线虫 生理盐水洗净后用加热至70～80℃的70%酒精或巴氏液(甲醛3份，生理盐水97份固定，冷却后移至新的70%酒精或巴氏液中保存。小型线虫(如旋毛虫、蛲虫、钩虫等)宜用甘油酒精(70%酒精95ml，甘油5ml)加热固定，保存于80%酒精中；也可用冰醋酸固定约半小时后移入70%酒精或甘油酒精中保存。

    2.吸虫 小型吸虫可置于小瓶中，加生理盐水，用力摇荡数分钟，倒去生理盐水，注入固定液。较大的吸虫应先放在薄荷脑酒精液(薄荷脑24g，95%酒精10ml)中，使虫体肌肉松弛，用载玻片压平后固定，或将洗净后的吸虫放在两片载玻片间用细线紧扎压平后固定。

    固定一般用10%甲醛，24小时后移至5%甲醛中保存；或用70%酒精固定0.5～3小时，视虫体大小而定，再移至新的70%酒精中保存。

    3.绦虫 大型绦虫(如猪、牛带绦虫)经清水洗涤数次后，在生理盐水(4℃)中经过数小时或过夜，虫体可完全伸展，此时以3%福尔马林固定，24小时后移至5%福尔马林中保存，必要时也可先用大玻璃板压平后固定。小型绦虫洗涤后可在3%福尔马林中固定3～5小时，用载玻片轻压，沿盖玻片边缘加5%甲醛固定数小时，最后保存在5%福尔马林溶液中。

    三、昆虫的保存

    1.干标本保存系保存有翅昆虫成虫。可用特制的昆虫针针插虫体。大型昆虫(蝇、虻等)用1～3号昆虫针，从虫体背面、中胸右侧直插(图22-9)。注意保持左侧完整，以便鉴定。小型昆虫(蚊、蛉、蚋、蠓等)可用00号短针自胸部腹面两中足基部之间插入，不可刺透胸背，再用另一长针从软木片另一端插下。最后各插一硬纸片，记录名称、采集地点与时间，并将之插于昆虫盒软木板上或玻璃管的软木塞上。昆虫盒内放入纸包的樟脑粉即可。如标本数量多(图22-9)，可保存于塑料管(或玻璃管)中，管底放少量樟脑粉，再铺上棉花、滤纸各一层，昆虫标本放于滤纸上，用软棉纸包棉花，轻塞在昆虫标本上方，瓶口加软木塞，再以蜡封之。

 

图22-9  有翅昆虫针插法

    2.湿标本保存用于保存有翅昆虫的卵和幼虫期及无翅昆虫和蜱螨类的发育各期。活标本先经加温的70%酒精(60～70℃)固定，一天后保存于5%甘油酒精(7%)中；也可用5%或10%福尔马林和Bless液固定保存。

    所有保存标本须详细记录标本名称、宿主、采集地点、采集日期及采集者姓名。

    樟脑混合剂配制：樟脑粉6份，氯仿1份，木馏油1份，石蜡油4份。先将樟脑粉1.5份与氯仿1份混合，随后加樟脑1.5份与木馏油1份，用玻璃棒混匀，最后加樟脑粉3份及石蜡油4份，再搅匀即可。