作者：admin发布时间：2012-11-01 19:12浏览：
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日本血吸虫卵：用直肠镜自直肠取米粒大小的粘膜一块，经水洗后，放在2载玻片间，轻轻压平，镜检。虫卵鉴别见表22-3。
表22-3 粘膜内血吸虫卵未染色之鉴别
| 活卵 | 近期变性卵 | 死卵(钙化卵) | |
| 颜色 | 淡黄至黄褐色 | 灰白至略黄色 | 灰褐色至棕红 |
| 卵壳 | 较薄 | 薄或不均匀 | 厚而不均匀 |
| 胚膜 | 清楚 | 清楚 | 不清楚 |
| 内含物 | 卵黄细胞或胚团或毛蚴 | 浅灰色或黑色小点或折光均匀的颗粒或萎缩的毛蚴 | 两极可有密集的黑点含网状结构或块状物 |
溶组织阿米巴：用乙状结肠镜观察溃疡形状，自溃疡边缘或深层刮取溃疡组织，置于载玻片上，加少量生理盐水，盖上盖片，轻轻压平，立即镜检。也可取出一小块病变的粘膜组织，固定切片，染色检查。
6.肺组织 检查卡氏肺孢子虫包囊。取一小块肺组织作涂片，自然干燥后甲醇固定，用改良银染色法进行染色。
改良银染色法染色步骤：
1.将肺涂片置于5%铬酸，氧化15分钟，温度为20℃。氧化后的标本均从流水冲洗数秒。
2.1%亚硫酸氢钠经1分钟，自来水冲洗后，蒸馏水洗涤3～4次。
3.放入四胺银工作液内，并在60℃孵育约90分钟，至标本转至黄褐色为止。流水、蒸馏水各洗5分钟。
4.0.1%氯化金2～5分钟，蒸馏水洗4～5次。
5.2%硫代硫酸钠5分钟，流水至少洗10分钟。
6.亮缘复染45秒。
7.95%，99%，100%乙醇逐级脱水。
8.二甲苯透明3次，树胶封片。
染色结果显示，卡氏肺孢子虫包囊呈圆形、卵圆形或不规则的多角形，囊壁为淡褐色或深褐色。红细胞为淡黄色，其余背景呈淡绿色。
二、免疫论断及新技术应用
(一)皮内试验
利用宿主的速发型变态反应，将特异抗原液注入皮内，观测皮丘及红晕反应以判断有无特异抗体(IgE)的存在称皮内试验(intradermal test，IDT)。
皮内试验用于多种寄生虫病的检测，如血吸虫病、肺吸虫病等。最常用于血吸虫病的调查，操作简单，并且可即时观察结果，适宜现场应用。大多用粗制可溶性血吸虫虫卵抗原(稀释度为1：4000)或成虫冷浸抗原(稀释度为1：8000)敏感性高，其阳性率在93%～97%，但有部分假阳性反应(2.1%～3.5%)，并且对其他寄生虫病交叉反应较高。皮内试验可用作①过筛方法，先作皮试，阳性者再作进一步追查 ；②临床辅助诊断；③考核预防效果，用作检查新感染的方法，特别对儿童。
(二)染色试验
染色试验(dye test，DT)是比较独特的免疫反应，是目前诊断弓形虫病较好的方法，已广泛用于该病的临床诊断和流行病学调查。
新鲜弓形虫滋养体和正常血清混合，在37℃作用1小时或室温数小时后，大部分弓形虫失去原来的新月形，而变为圆形或椭圆形，用碱性美蓝染色时着色很深。但新鲜弓形虫和免疫血清混合时，虫体仍保持原有形态，用碱性美蓝染色时，着色很浅或不着色。其原因可能是由于弓形虫受到特异体抗体和辅助因子协同作用后，虫体细胞变性，结果虫体对碱性美蓝不易着色。
材料和试剂以弓形虫速殖子为抗原；采用正常人血清为致活因子。碱性美蓝溶液，取美蓝10g加入95%酒精100ml，制成饱和酒精溶液，过滤后取3ml加pH11，要求临用时新鲜配制。待检血清经56℃30分钟灭活，冰箱保存备用。
方法将待检血清用生理盐水倍比稀释，每孔0.1ml，加上述稀释的弓形虫速殖子0.1ml，置37℃水浴1小时，加碱性美蓝溶液0.02ml/孔，37℃水浴15分钟，以每孔聚悬液1滴于载玻片上，加盖玻片，高倍显微镜检查，计数100个弓形虫速殖子，统计着色和不着色速殖子比例数。
结果判定以能使50%弓形虫不着色的血清最高稀释度为该血清染色试验阳性效价。阳性血清稀释度1：8为隐性感染；1：256为活动性感染；1：1024为急性感染。
(三)环卵沉淀试验
环卵沉淀试验(circumoval precipitin test，COPT)是以血吸虫整卵为抗原的特异免疫血清学试验，卵内毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物质经卵壳微孔渗出与检测血清内的特异抗体结合，可在虫卵周围形成特殊的复合物沉淀，在光镜下判读反应强度并计数反应卵的百分率称环沉率。
1.常规法用载玻片或凹玻片进行，加样本血清后，挑取适量鲜卵或干卵(约100～150个，从感染动物肝分离)，覆盖24×24mm盖片，四周用石蜡密封，37℃保温48小时后，低倍镜观察结果，必要时需观察72小时的反应结果。典型的阳性反应为泡状、指状、片状或细长卷曲状的折光性沉淀物，边缘整齐，与卵壳牢固粘连。阴性反应必须观察全片；阳性者观察100个成熟卵，计环沉率及反应强度比例。环沉率是指100个成熟虫卵中出现沉淀物的虫卵数。凡环沉率≥5%者可报告为阳性，(在基本消灭和消灭血吸虫病地区环沉率≥3%者可判为阳性)，1%～4%者为弱阳性。环沉率在治疗上具有参考意义。
2.分级强度判定
“-”折光淡，与虫卵似连非连；“影状”物(外形不甚规则，低倍镜下有折光，高倍镜下为颗粒状)及出现直径小于10μm的泡状沉淀物者，皆为阴性。
“+”虫卵外周出现泡状沉淀物(>10μm)，累计面积小于虫卵面积的1/2；或呈指状的细长卷曲样沉淀物，不超过虫卵的长径。
“++”虫卵外周出现泡状沉淀物的面积大于虫卵面积的1/2；或细长卷曲样沉淀相当或超过虫卵的长径。
“+++”虫卵外周出现泡状沉淀物的面积大于虫卵本身面积；或细长卷曲样沉淀物相当或超过虫卵长径的2倍。
3.近年来对COPT的方法作了一些改进如①双面胶纸条法：将双面胶纸条制特定的式样作COPT，可省略蜡封片法的繁琐步骤，具有操作简易，方法规范，提高工效和避免空气污染的优点。双面胶纸条法COPT(DGS-COPT)已在现场扩大应用，今后若能将该法配套干卵，则更能提高它的应用价值；②血吸虫干卵抗原片(或膜片)环卵沉淀试验，利用环卵抗原活性物质的耐热特性，将分离的纯卵超声和热处理，定量滴加，烤干固定于载玻片或预制的聚乙稀薄膜上。此种干卵膜片，保存时间较长(4℃半年)，已有市售商品。试验时只需加入血清试样，湿盒孵育，判读结果与常规法相同。干卵膜片法还具有简化操作规程，提高卵抗原的规范要求，并可长期保存等优点。
COPT可作为诊断血吸虫病的血清学方法之一，及临床治疗病人的依据；可用作考核治疗和防治效果的方法；并且用于血清流行病学调查及监测疫情的方法。
(四)间接血凝试验
间接血凝试验(indirect haemagglutination test，IHA)是以红细胞作免疫配体的载体，并以红细胞凝集读数的血清学方法。最常用的红细胞为绵羊或人(O型)红细胞，来源方便。目前均用醛化红细胞，可保存半年而不失其免疫吸附性能。
操作步骤如下：
1.红细胞鞣化和致敏 ①取醛化红细胞用0.15mol/L，pH7.2PBS离心洗涤2次，并用PBS配成2.5%悬液；②加等量1:2000鞣酸溶液(鞣酸不同批号，质量相差较大必须预试测定适宜浓度)37℃孵育20分钟，经常摇动；③离心去上清，PBS洗1次，再用0.15mol/L，pH6.4PBS配成10%悬液；④每份悬液加等量适当稀释的抗原液，置于37℃水浴箱中30分钟(每5分钟振动一次)，离心去上清，pH7.2PBS洗2次，再用含1%正常兔血清(NRS)10%蔗糖缓冲液配成5%细胞悬液。加1‰叠氮钠防腐，存4℃或减压冻干备用，每批致敏细胞均需用已知阳性和阴性血清滴定灵敏度或特异性。阳性滴度在1:640以上，阴性血清不出现反应者可用。
2.微量血凝试验 在U型(或V型)微量血凝板上，将被试血清用1%NRS或BSA生理盐水作倍比系列稀释，每孔含稀释血清0.05ml。每孔加0.01ml致敏红细胞悬液(可用标定过的OT针头滴加)，充分振荡摇匀，加盖于室温静置1～2小时读取结果。
3.根据红细胞在孔底的沉积类型而定。“-”，红细胞沉于管底，呈圆点形，外周光滑；“±”，红细胞沉于管底，周围不光滑或中心有白色小点；“+”，红细胞沉积范围很小，呈较明显的环形圈；“++”，红细胞沉积范围较小，其中可出现淡淡的环形圈；“+++”，红细胞布满管底呈毛玻璃状；“++++”，红细胞呈片状凝集或边缘卷曲。呈明显阳性反应(+)的最高稀释度为该血清的滴度或效价。
目前对血吸虫病应用纯化虫卵抗原间接血凝试验。采用经SephadexG-100柱层析纯化的血吸虫卵抗原致敏红细胞作IHA，提高了方法的敏感性，特异性和重现性，为在疫区扩大应用提供了条件。
IHA操作简便，敏感性高，适于现场使用，可作为辅助论断病人，流行病学调查及综合查病方法。先后在多种寄生虫感染中应用，如血吸虫，疟疾、猪囊虫，旋毛虫，肺吸虫，阿米巴，弓形虫，肝吸虫等。有些已制成商品诊断药盒。不足之处是不能提供检测抗体的亚型类别，和容易发生异常的非特异凝集。另外抗原的标准化，操作方法规范化急待解决，以提高其诊断效果和可比性。
(五)免疫荧光法
免疫荧光法(immunofluorescent method，IF)是借抗原抗体反应进行特异荧光染色的诊断技术。最常用的荧光素为异硫氰基荧光素(fluorescein isothiocynate，FITC)。常用于寄生虫感染的荧光抗体染色有直接法与间接法。
1.直接法 用于检测抗原，其缺点是每查一种抗原必须制备与其相应的荧光标记的抗体。目前很少应用。
2.间接法 也称间接荧光抗体法(indirect fluorescent antibody method，IFA)。将抗原与未标记的特异性抗体(如患者血清)结合，然后使之与荧光标记的抗免疫球蛋白抗体(抗抗体)结合，三者的复合物可发出荧光。本法的优点是制备一种荧光标记的抗体，可以用于多种抗原，抗体系统的检查，即可用以测定抗原，也可用来测定抗体。IFA的抗原可用虫体或含虫体的组织切片或涂片，经充分干燥后低温长期保存备用。一张载片可等距置放多个抗原位点用以同时检测多个样本或确定滴度。
IFA的操作步骤如下：①抗原标本：用记号笔或蜡笔将各个抗原位点围圈隔离；②在每个抗原位置滴加已稀释的血清样本或样本稀释系列，使样本液充满圈内，置湿匣37℃孵育30分钟；③用pH8.0 0.01mol/L PBS冲后再置同样PBS液中浸泡5分钟，不时摇动，如此2遍，然后取出吹干；④在抗原位点滴加经pH8.0PBS适当稀释的羊抗人IgG荧光抗体(每批结合物的工作浓度需经滴定)，使完全覆盖抗原膜，置湿盒37℃孵育30分钟；⑤经洗涤(同③)后用0.1‰伊文思蓝液复染10分钟，然后以PBS流水冲洗0.5～1分钟，风干；⑥用pH8.5或pH8.0碳酸(或磷酸)缓冲甘油封片，也可加一小滴PBS(pH8.0)覆以盖片镜检。镜检应及时进行以免疫光衰变。可使用荧光光源或轻便荧光光源，配以适合的激发滤片和吸收滤片，在低倍或高倍镜下检查。以见有符合被检物形态结构的黄绿色清晰荧光发适合的激发滤片和吸收滤片，在低倍或高倍镜下检查。以见有符合被检物形态结构的黄绿色清晰荧光发光体、而阴性对照不可见者为阳性反应。根据荧光亮度及被检物形态轮廓的清晰度把反应强度按5级区别(+++，++，+，±，-)。+以上的荧光强度为阳性。
该法具有较高的敏感性、特异性和重现性，应用抗原经济。国内外广泛应用于寄生虫病的血清学诊断方法，血清流行病学调查和监测疫情的方法，如主要用于诊断疟疾、丝虫病及血吸虫病，也有用于肺吸虫病、华支睾吸虫病、包虫病及弓形虫病的血清学诊断。
近10年来，国内学者对IFA进行了很多改进。李允鹤等(1984，1988)通过深入研究，确定了感染鼠肝细胞内虫卵冰冻切片为IFA较为理想的诊断抗原。该法需用荧光显微镜判断结果，限制了它的应用范围。但是应用该法时必须具备的荧光抗体，目前国内已有商品供应，这为IFA的扩大应用，提供了条件。
(六)对流免疫电泳试验
对流免疫电泳试验(counter-immunao electrophoretic assay，CIE)以琼脂或琼脂糖凝胶为基质的一种快速，敏感的电泳技术。
对流电泳较简单的扩散法和常规免疫电泳法至少敏感10～20倍，省时，省料，可用已知抗原检测抗体或相反，反应结果特异，阳性反应的可信度高，适用范围广。近年来本法的改进已试用酶或放射标记的反应配体，如酶标记抗原对流免疫电泳(ELACIE)、放射对流免疫电泳自显影术(RCIEA)等。以克服电泳技术本身不够灵敏的弱点，国内在血吸虫病、肺吸虫病免疫诊断已获良好结果。国外报道应用于阿米巴病、锥虫病、棘球蚴病、旋毛蚴病、血吸虫病等血清学诊断。