寄生虫学实验诊断技术(6)

 孔0.1（或0.2）ml包被反应板，37℃湿盒温育2～3小时或4℃过夜；
2）弃去包被液，反应板用去离子水或PBS－Tween液（0.005mol／L PBS含0.05％Tween-20）冲洗3次，甩干；
3）用样本稀释液（0.05mol／L PBS含0.05％Tween-20）稀释样本（起始浓度≥100－1），用样本稀释液（每孔0.1（或0.2）ml，温育1小时；
4）弃去样液，如上冲洗，甩干加稀释结合物（市售品常稀释至100－1，用样本稀释液），每孔0.1（或0.2）ml，温育1～2小时；
5）如上冲洗甩干后即刻加入新鲜配制的底物系统，每孔0.1（或0.2）ml，置暗盒室温15分钟；
6）终止反应：HRP－OPD系统每孔加1mol／LH2SO450µl；
7）目测或用分光光度计在400µm波段测定吸收值来判断。

　　⑵双抗体夹心法：

　　1）以包被液稀释抗体（如兔抗血吸虫虫卵可溶性抗原的抗体，抗SEA－IgG）包被反应板（1～1000µg/ml），方法同间接法包被抗原；
2）冲洗，甩干，加样温育同前（起始浓度≥5－1）；
3）加结合物（例如抗SEA－IgG－HRP），适宜工作浓度需先经方阵滴定确定；
4）以下各步同间接法。

　　若包被抗体与第二抗体来自不同种的供体则可应用市售抗免疫球蛋白结合物。例如包被抗体为羊抗SEA，二抗用兔抗SEA则在未标记的二抗温育洗涤后加羊抗兔IgG结合物（GAP－HRP）。

　　[附]酶标记物制备：应用抗原或抗体与酶分子的交联技术，交联物亦称酶结合物（conjugate）。根据酶与抗体（抗原）的激活顺序，交联反应可分一步法、二步法及三步法不等。其中以二步法中的过碘酸钠法多用，戊二醛一步法反应率较低，较适用于交联AKP。免疫球蛋白标记辣根过氧化物酶（过碘酸钠法）与免疫球蛋白标记碱性磷酸脂酶（戊二醛一步法），按常规方法制备。

　　抗IgG型抗体酶结合物也可用金黄色葡萄球菌A－蛋白酶结合物替代，称A－蛋白酶联试验（SPA－ELISA）。A－蛋白辣根过氧化物酶结合物（PA－HRP）已有市售标准品，其敏感度稍逊于抗体酶结合物。

　　底物配制：不同的酶要求选择相应底物，以下为分别适用于比色和肉眼读取结果的两种HRP常用底物配制。

　　邻苯二胺（OPD）：经HRP催化后生成橘红色产物。40mgOPD溶于柠檬酸磷酸缓冲液（pH5.0）100ml（含24.3ml 0.1mol／L柠檬酸，25.7ml0.02mol／L Na2HPO4加水50ml），临用前加30％H2O20.15ml，温育15分钟后用2mol／l H2SO4终止反应，492nm读数。本底物具高度敏感性，显色梯度良好，生成可溶性产物，有利于比色读数，但为光敏感，反应时应置暗盒内；也具致突变作用。

　　5－氨基水杨酸（5AS）：经HRP催化生成棕色产物。8mg5AS溶于10ml50℃温热蒸馏水中，置4℃暗处不超过3天，临用前以1n NaOH调pH至6.0，加0.05％H2O2 1ml。37℃经30～60分钟温浴后用1n NaOH终止反应，肉眼或449nm比色。本底物无致突变作用，生成棕褐色不全溶解的产物有利于肉眼判读结果。

　　酶联试验为高灵敏检测技术，结果可定量表示，可检测抗体、抗原或特异性免疫复合物，微量滴定板法消耗样本试剂少，能供全自动操作，适用批量样本检测，因此在寄生虫感染的研究和诊断领域乃至血清流行病学均被广泛应用。国内外有多种寄生虫感染的酶联药籍出售，包括有血吸虫病、弓形虫病、阿米巴病、丝虫病、蛔虫病、旋毛虫病和犬蛔虫病等，ELISA可用作辅助诊断病人，血清流行病学调查和监测疫情的方法。酶联试验操作程序的简单快速不如IHA，但方法具有很大所改良潜力和适应范围。判断结果需用分光光度计，限制了扩大应用；另外，应用抗原及酶结合物尚需进一步标准化，操作方法也应规范化。

　　近年来已有多种改进的酶联免疫吸附试验如①快速－ELISA：改进特点为用PVC薄膜代替聚苯乙烯微量反应板作载体；将1％可溶性血吸虫卵抗原与尿素溶解性血吸虫卵抗原等量相混合预吸附于薄膜上；用抗人Igg McAb代替羊抗人IgG制备酶结合物；用底物TMB代替OPD。该法主要以目视法判断结果，整个操作流程仅需20min左右。②硫酸铵沉淀抗原－ELISA：可溶性血吸虫卵抗原经饱和硫酸铵沉淀后用作ELISA诊断抗原；在系列实验基础上，使操作方法达到规范化；用质量控制图控制检测差异，并以标准曲线单位判断结果；缩短检测时间，节省检测时间，节省试液用量，提高了敏感性，特异性和重现性。

　　（八）斑点ELISA

　　斑点ELISA（dot-ELISA）是近年新发展的一种ELISA技术，选用对蛋白质有很强吸附能力的硝酸纤维素薄膜作固相载体，底物经酶促反应后形成有色沉淀物使薄膜着色，然后目测或用光密度扫描仪定量。dot-ELISA可用来检测抗体，也可用来检测抗原，由于该法检测抗原时操作较其他免疫学试验简便，故目前多用于抗原检测。

　　操作方法将待检血清作1:1～1:20稀释，用微量加样器将1µl血清点滴于硝酸纤维素膜（NC）上，置于70℃经1h，将NC浸于1％BSA－PBS中，室温摇荡1小时，洗涤2次，加1：1000稀释的McAb酶标记物，室温摇荡2小时，洗涤3次后，加底物3，3'二氨基联苯胺或4氯－1－乙萘酚，15分钟后，流水终止反应，以目视法判断结果。凡显示棕色斑点者为阳性，否则为阴性。以产生棕色斑点反应的最高稀释度为抗原滴度。

　　该法简易，快速，适合于现场应用，有广阔的应用前景。现有的资料初步证明具有诊断病人和考核治疗效果，国内已用于血吸虫病，疟疾，丝虫病，棘球蚴病的诊断。国内学者曾比较斑点ELISA和双抗体夹心ELISA用于检测班氏丝虫病人循环抗原。采用相同的单克隆抗体和病人血清进行两种方法对比试验。结果显示两种方法检测的特异性均大于95％，但是它们的敏感性有明显不同，斑点ELISA能检测出血清中0.055ng/ml微丝蚴抗原，而双抗体夹心ELISA仅能测出≥10ng/ml抗原；并且前者不需要特殊的设备，适用于丝虫病流行区。另有报告用单克隆抗体－抗原斑点试验（McAb-AsT）检测血清抗原诊断黑热病，效果较为满意，方法上进一步简化，加样以原浓度血清反应，效果最佳。国外还用于旋毛虫病、丝虫病、弓形虫病以及肺孢子虫病的血清学诊断方法。

　　（九）免疫酶染色试验

　　免疫酶染色试验（immunoenzymic　staining　test，IEST）是以含寄生虫病原的组织切片，印片或培养物涂片用作抗原进行过氧化物酶特异免疫染色后在光镜下检示样本中的特异性抗体。在蠕虫和原虫感染中均有多种应用。

　　操作过程抗原组织作冰冻（5～10µm）或石蜡连续切片（4～8µm）排列于载玻片，经丙酮固定贮存于－20℃备用。原虫纯培养亦可制成分隔涂片，方法均同荧光染色法抗原制片。试验时先将抗原片在稀释的过氧化氢溶液浸泡15分钟，除去可能存在于组织中的内源性过氧化物酶；抗原片用PBS冲洗后经Tris缓冲液（PBS，pH7.6）10倍稀释的正常兔或羊血清培育10分钟，迅速以PBS洗涤后加检测样本（单个或系列稀释度），置湿盒室温（20～25℃）或37℃培育30分钟；PBS洗涤3次，每次5分钟，然后加兔或羊抗人过氧化物酶结合物（参照ELISA法），结合物中可加入所用抗原组织片供体动物血清约1／25～1／3体积，用以阻断可能交叉反应，降低背景色度；抗原片以PBS洗涤3次后加联苯胺（DAB）底物溶液（饱和联苯胺液加等量pH7.6硼酸缓冲液，用前按9:1体积加入0.1％H2O2液），室温显色10～15分钟后在光镜下观察反应结果。

　　反应标准：“－”，组织内抗原部位不呈现棕红色；“＋”，组织内抗原部位（如血吸虫肝卵切片中的虫卵）呈现棕红色；“＋＋”，局部呈现清晰的棕红色；“＋＋＋”，呈现非常清晰的棕红色。

　　该法简单，节省抗原；判断结果不需要特殊仪器；适合于现场应用。IEST可用作辅助诊断病人，考核疗效，血清流行病学调查及监测疫情的方法。目前主要应用于血吸虫病、丝虫病及囊虫病诊断，也可用来诊断华支囊吸虫病、肺吸虫病、包虫病和弓形虫病。

　　目前对该方法改进有：①用感染鼠肝组织内虫卵制成7µm厚度冰冻切片（或石蜡切片）作为诊断用固相抗原代替可溶性血吸虫卵抗原作IEST，具有取材容易和应用抗原经济的优点。②将冰冻切片置于载玻片上，可以反复使用载玻片，较一次性用的PVC薄膜／苯氯乙烯反应板价廉，显著地降低了检测费用。③判断结果时，应用普通光镜即可。染色标本不必即时检查。可保存很长时间，便于复查。④阳性血清作最高滴度，可定量抗体水平，用作考核疗效有及防治效果的指标。⑤IEST的反应基本原理与COPT相似，但前者应用切片虫卵代替了COPT的整个干卵，前法的反应快速（约1.5～2小时）而后法较缓慢（需48～72小时）。为此，IEST弥补了COPT