寄生虫学实验诊断技术(5)

处理，定量滴加，烤干固定于载玻片或预制的聚乙稀薄膜上。此种干卵膜片，保存时间较长（4℃半年），已有市售商品。试验时只需加入血清试样，湿盒孵育，判读结果与常规法相同。干卵膜片法还具有简化操作规程，提高卵抗原的规范要求，并可长期保存等优点。

　　COPT可  作为诊断血吸虫病的血清学方法之一，及临床治疗病人的依据；可用作考核治疗和防治效果的方法；并且用于血清流行病学调查及监测疫情的方法。

　　（四）间接血凝试验

　　间接血凝试验（indirect　haemagglutination　test，IHA）是以红细胞作免疫配体的载体，并以红细胞凝集读数的血清学方法。最常用的红细胞为绵羊或人（O型）红细胞，来源方便。目前均用醛化红细胞，可保存半年而不失其免疫吸附性能。

　　操作步骤如下：

　　1．红细胞鞣化和致敏　①取醛化红细胞用0.15mol／L，pH7.2PBS离心洗涤2次，并用PBS配成2.5％悬液；②加等量1:2000鞣酸溶液（鞣酸不同批号，质量相差较大必须预试测定适宜浓度）37℃孵育20分钟，经常摇动；③离心去上清，PBS洗1次，再用0.15mol／L，pH6.4PBS配成10％悬液；④每份悬液加等量适当稀释的抗原液，置于37℃水浴箱中30分钟（每5分钟振动一次），离心去上清，pH7.2PBS洗2次，再用含1％正常兔血清（NRS）10％蔗糖缓冲液配成5％细胞悬液。加1‰叠氮钠防腐，存4℃或减压冻干备用，每批致敏细胞均需用已知阳性和阴性血清滴定灵敏度或特异性。阳性滴度在1:640以上，阴性血清不出现反应者可用。

　　2．微量血凝试验　在U型（或V型）微量血凝板上，将被试血清用1％NRS或BSA生理盐水作倍比系列稀释，每孔含稀释血清0.05ml。每孔加0.01ml致敏红细胞悬液（可用标定过的OT针头滴加），充分振荡摇匀，加盖于室温静置1～2小时读取结果。

　　3．根据红细胞在孔底的沉积类型而定。“－”，红细胞沉于管底，呈圆点形，外周光滑；“±”，红细胞沉于管底，周围不光滑或中心有白色小点；“＋”，红细胞沉积范围很小，呈较明显的环形圈；“＋＋”，红细胞沉积范围较小，其中可出现淡淡的环形圈；“＋＋＋”，红细胞布满管底呈毛玻璃状；“＋＋＋＋”，红细胞呈片状凝集或边缘卷曲。呈明显阳性反应（＋）的最高稀释度为该血清的滴度或效价。

　　目前对血吸虫病应用纯化虫卵抗原间接血凝试验。采用经SephadexG－100柱层析纯化的血吸虫卵抗原致敏红细胞作IHA，提高了方法的敏感性，特异性和重现性，为在疫区扩大应用提供了条件。

　　IHA操作简便，敏感性高，适于现场使用，可作为辅助论断病人，流行病学调查及综合查病方法。先后在多种寄生虫感染中应用，如血吸虫，疟疾、猪囊虫，旋毛虫，肺吸虫，阿米巴，弓形虫，肝吸虫等。有些已制成商品诊断药盒。不足之处是不能提供检测抗体的亚型类别，和容易发生异常的非特异凝集。另外抗原的标准化，操作方法规范化急待解决，以提高其诊断效果和可比性。

　　（五）免疫荧光法

　　免疫荧光法（immunofluorescent　method，IF）是借抗原抗体反应进行特异荧光染色的诊断技术。最常用的荧光素为异硫氰基荧光素（fluorescein 　isothiocynate，FITC）。常用于寄生虫感染的荧光抗体染色有直接法与间接法。

　　1．直接法　用于检测抗原，其缺点是每查一种抗原必须制备与其相应的荧光标记的抗体。目前很少应用。
2．间接法　也称间接荧光抗体法（indirect　fluorescent antibody 　method，IFA）。将抗原与未标记的特异性抗体（如患者血清）结合，然后使之与荧光标记的抗免疫球蛋白抗体（抗抗体）结合，三者的复合物可发出荧光。本法的优点是制备一种荧光标记的抗体，可以用于多种抗原，抗体系统的检查，即可用以测定抗原，也可用来测定抗体。IFA的抗原可用虫体或含虫体的组织切片或涂片，经充分干燥后低温长期保存备用。一张载片可等距置放多个抗原位点用以同时检测多个样本或确定滴度。

　　IFA的操作步骤如下：①抗原标本：用记号笔或蜡笔将各个抗原位点围圈隔离；②在每个抗原位置滴加已稀释的血清样本或样本稀释系列，使样本液充满圈内，置湿匣37℃孵育30分钟；③用pH8.00.01mol／L PBS冲后再置同样PBS液中浸泡5分钟，不时摇动，如此2遍，然后取出吹干；④在抗原位点滴加经pH8.0PBS适当稀释的羊抗人IgG荧光抗体（每批结合物的工作浓度需经滴定），使完全覆盖抗原膜，置湿盒37℃孵育30分钟；⑤经洗涤（同③）后用0.1‰伊文思蓝液复染10分钟，然后以PBS流水冲洗0.5～1分钟，风干；⑥用pH8.5或pH8.0碳酸（或磷酸）缓冲甘油封片，也可加一小滴PBS（pH8.0）覆以盖片镜检。镜检应及时进行以免疫光衰变。可使用荧光光源或轻便荧光光源，配以适合的激发滤片和吸收滤片，在低倍或高倍镜下检查。以见有符合被检物形态结构的黄绿色清晰荧光发适合的激发滤片和吸收滤片，在低倍或高倍镜下检查。以见有符合被检物形态结构的黄绿色清晰荧光发光体、而阴性对照不可见者为阳性反应。根据荧光亮度及被检物形态轮廓的清晰度把反应强度按5级区别（＋＋＋，＋＋，＋，±，－）。＋以上的荧光强度为阳性。

　　该法具有较高的敏感性、特异性和重现性，应用抗原经济。国内外广泛应用于寄生虫病的血清学诊断方法，血清流行病学调查和监测疫情的方法，如主要用于诊断疟疾、丝虫病及血吸虫病，也有用于肺吸虫病、华支睾吸虫病、包虫病及弓形虫病的血清学诊断。

　　近10年来，国内学者对IFA进行了很多改进。李允鹤等（1984，1988）通过深入研究，确定了感染鼠肝细胞内虫卵冰冻切片为IFA较为理想的诊断抗原。该法需用荧光显微镜判断结果，限制了它的应用范围。但是应用该法时必须具备的荧光抗体，目前国内已有商品供应，这为IFA的扩大应用，提供了条件。

　　（六）对流免疫电泳试验

　　对流免疫电泳试验（counter-immunao　electrophoretic 　assay，CIE）以琼脂或琼脂糖凝胶为基质的一种快速，敏感的电泳技术。

　　对流电泳较简单的扩散法和常规免疫电泳法至少敏感10～20倍，省时，省料，可用已知抗原检测抗体或相反，反应结果特异，阳性反应的可信度高，适用范围广。近年来本法的改进已试用酶或放射标记的反应配体，如酶标记抗原对流免疫电泳（ELACIE）、放射对流免疫电泳自显影术（RCIEA）等。以克服电泳技术本身不够灵敏的弱点，国内在血吸虫病、肺吸虫病免疫诊断已获良好结果。国外报道应用于阿米巴病、锥虫病、棘球蚴病、旋毛蚴病、血吸虫病等血清学诊断。

　　（七）酶联免疫吸附试验

　　酶联免疫吸附试验（enzyme-linked　immunosorbent assay．ELISA）简称酶联试验，已广泛用于多种寄生虫感染的宿主体液（血清，脑脊液等）以及排泄分泌物（尿，乳，粪便等）内特异抗体或抗原微粒的检测。根据检测要求，试验可分多种类型，常用者有：用于检测抗体的间接法；检测IgM的双夹心法；检测抗原的双抗体夹心法；以固相抗体检测抗原的竞争法以及竞争抑制法等（图21－8）。

图21－8　酶联免疫吸附试验常用方法示意图

　　酶联试验的方法根据所用载体、酶底物系统、观察反应结果等不同而有很大差别。目前最常用的固相载体为聚苯乙稀微量滴定板，具有需样少，敏感，重演性好，使用方便等优点。酶底物系统也有多种，常用的有辣根过氧化物酶－邻苯二胺（HRP－OPD）、碱性磷酸酯酶－硝酚磷酸盐（AKP－PNP）等，具有较好的生物放大效应。其中HRP由于价廉、易得而被广泛应用。

　　酶联试验的基本操作过程可分为：①固相包被；②温育洗涤；③加样；④酶结合物反应；⑤底物显色；⑥终止反应读取结果等若干步骤。温育和洗涤需贯穿在每二步骤之间，用以去除多余的反应物。以下为临床上最常用的间接法（检测抗体）和双抗体夹心法（检测抗原）的操作程序：

　　⑴间接法：

　　1）以包被液（碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液0.05mol／L，pH9.6）稀释抗原（常用5～10µg/ml），每