寄生虫学实验诊断技术(4)

 阴道后穹窿、子宫颈及阴道壁上取分泌物，然后在有1～2滴生理盐水的载玻片上作涂片镜检，可发现活动的虫体。天气寒冷时，应注意保温。

　　悬滴法：取阴道分泌物置于周缘涂抹一薄层凡士林盖片上的生理盐水中，翻转盖片小心覆盖在具凹孔的载玻片上，稍加压使两片粘合，液滴悬于盖片下面，镜检。

　　（四）其它器官组织检查

　　1．骨髓穿刺　主要检查杜氏利什曼原虫无鞭毛体。一般常作髂骨穿刺，患者侧卧，露出髂骨部位。视年龄大小，选用17～20号带有针芯的干燥无菌穿刺针，从髂骨前上刺后约1cm处刺入皮下，当针尖触及骨面时，再慢慢地钻入骨内约0.5～1.0cm，即可拔出针芯，接上2ml的干燥注射器，抽取骨髓液。取少许骨髓液作涂片；甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油镜检。

　　2．淋巴结穿刺

　　⑴利什曼原虫：检出率低于骨髓穿刺，但方法简便、安全，且患者经治疗后，淋巴结内原虫消失较慢，故仍有一定价值。一般选腹股沟部，先将局部皮肤消毒，用左手拇指和食指捏住一个较大的淋结，右手取干燥无菌的6号针头刺入淋巴结，此时淋巴结组织液自能进入针内。稍待片刻，拔出针头，将针头内少量的淋巴结组织液注于载玻片上，作涂片染色检查。也可用摘除的淋巴结的切面做涂片，染色后镜检。

　　⑵丝虫成虫：可用注射器从可疑的淋巴结节中抽取成虫，或剖检摘除的结节寻找成虫，也可作病理组织切片检查。

　　3．肌肉活检

　　⑴旋毛虫幼虫：用外科手术从患者的腓肠肌或肱或股二头肌取米粒大小的肌肉一块，置于载玻片上，加50％甘油滴，盖上另一载玻片，均匀用力压紧，低倍镜下观察。取下肌肉须立即检查，否则幼虫变得模糊，不易检查。

　　⑵猪囊尾蚴：摘取肌肉内的结节，剥除外层纤维被膜，在2张载玻片间压平、镜检。也可经组织固定后作切片染色检查。

　　4．皮肤　检查疥螨，蠕形螨，利什曼原虫等。

　　⑴疥螨：参看“疥螨和疥疮”！一节。
　⑵蠕形螨：参看“蠕形螨和蠕形螨病”一节。
　⑶利什曼原虫：在皮肤上出现丘疹和结节等疑似皮肤型黑热病患者，可选择皮损较明显之处，作局部消毒，用干燥灭菌的注射器，刺破皮损处，抽取组织液作涂片；或用消毒的锋利小剪，从皮损表面剪取一小片皮肤组织，以切面作涂片；也可用无菌解剖刀切一小口，刮取皮肤组织作涂片。以上涂片均用瑞氏或姬氏染液染色。如涂片未见原虫，可割取小丘疹或结节，固定后，作组织切片染色检查。

　　5．直肠粘膜　用直肠镜从直肠粘膜病变组织内可查见日本血吸虫卵及溶组织阿米巴滋养体。

　　日本血吸虫卵：用直肠镜自直肠取米粒大小的粘膜一块，经水洗后，放在2载玻片间，轻轻压平，镜检。虫卵鉴别见表21。－3。

表21－3　粘膜内血吸虫卵未染色之鉴别

活卵 近期变性卵 死卵（钙化卵） 颜色 淡黄至黄褐色 灰白至略黄色 灰褐色至棕红 卵壳 较薄 薄或不均匀 厚而不均匀 胚膜 清楚 清楚 不清楚 内含物 卵黄细胞或胚团或毛蚴 浅灰色或黑色小点或折光均匀的颗粒或萎缩的毛蚴 两极可有密集的黑点含网状结构或块状物
　　溶组织阿米巴：用乙状结肠镜观察溃疡形状，自溃疡边缘或深层刮取溃疡组织，置于载玻片上，加少量生理盐水，盖上盖片，轻轻压平，立即镜检。也可取出一小块病变的粘膜组织，固定切片，染色检查。

　　6．肺组织　检查卡氏肺孢子虫包囊。取一小块肺组织作涂片，自然干燥后甲醇固定，用改良银染色法进行染色。

　　改良银染色法染色步骤：

　　1．将肺涂片置于5％铬酸，氧化15分钟，温度为20℃。氧化后的标本均从流水冲洗数秒。
2．1％亚硫酸氢钠经1分钟，自来水冲洗后，蒸馏水洗涤3～4次。
3．放入四胺银工作液内，并在60℃孵育约90分钟，至标本转至黄褐色为止。流水、蒸馏水各洗5分钟。
4．0.1％氯化金2～5分钟，蒸馏水洗4～5次。
5．2％硫代硫酸钠5分钟，流水至少洗10分钟。
6．亮缘复染45秒。
7．95％，99％，100％乙醇逐级脱水。
8．二甲苯透明3次，树胶封片。

　　染色结果显示，卡氏肺孢子虫包囊呈圆形、卵圆形或不规则的多角形，囊壁为淡褐色或深褐色。红细胞为淡黄色，其余背景呈淡绿色。

（陈佩惠 姜洪杰）

　　二、免疫论断及新技术应用

　　（一）皮内试验

　　利用宿主的速发型变态反应，将特异抗原液注入皮内，观测皮丘及红晕反应以判断有无特异抗体（IgE）的存在称皮内试验（intradermal 　test，IDT）。

　　皮内试验用于多种寄生虫病的检测，如血吸虫病、肺吸虫病等。最常用于血吸虫病的调查，操作简单，并且可即时观察结果，适宜现场应用。大多用粗制可溶性血吸虫虫卵抗原（稀释度为1：4000）或成虫冷浸抗原（稀释度为1：8000）敏感性高，其阳性率在93％～97％，但有部分假阳性反应（2.1％～3.5％），并且对其他寄生虫病交叉反应较高。皮内试验可用作①过筛方法，先作皮试，阳性者再作进一步追查；②临床辅助诊断；③考核预防效果，用作检查新感染的方法，特别对儿童。

　　（二）染色试验

　　染色试验（dye　test，DT）是比较独特的免疫反应，是目前诊断弓形虫病较好的方法，已广泛用于该病的临床诊断和流行病学调查。

　　新鲜弓形虫滋养体和正常血清混合，在37℃作用1小时或室温数小时后，大部分弓形虫失去原来的新月形，而变为圆形或椭圆形，用碱性美蓝染色时着色很深。但新鲜弓形虫和免疫血清混合时，虫体仍保持原有形态，用碱性美蓝染色时，着色很浅或不着色。其原因可能是由于弓形虫受到特异体抗体和辅助因子协同作用后，虫体细胞变性，结果虫体对碱性美蓝不易着色。

　　材料和试剂以弓形虫速殖子为抗原；采用正常人血清为致活因子。碱性美蓝溶液，取美蓝10g加入95％酒精100ml，制成饱和酒精溶液，过滤后取3ml加pH11，要求临用时新鲜配制。待检血清经56℃30分钟灭活，冰箱保存备用。

　　方法将待检血清用生理盐水倍比稀释，每孔0.1ml，加上述稀释的弓形虫速殖子0.1ml，置37℃水浴1小时，加碱性美蓝溶液0.02ml／孔，37℃水浴15分钟，以每孔聚悬液1滴于载玻片上，加盖玻片，高倍显微镜检查，计数100个弓形虫速殖子，统计着色和不着色速殖子比例数。

　　结果判定以能使50％弓形虫不着色的血清最高稀释度为该血清染色试验阳性效价。阳性血清稀释度1：8为隐性感染；1：256为活动性感染；1：1024为急性感染。

　　（三）环卵沉淀试验

　　环卵沉淀试验（circumoval　precipitin　test，COPT）是以血吸虫整卵为抗原的特异免疫血清学试验，卵内毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物质经卵壳微孔渗出与检测血清内的特异抗体结合，可在虫卵周围形成特殊的复合物沉淀，在光镜下判读反应强度并计数反应卵的百分率称环沉率。

　　1．常规法用载玻片或凹玻片进行，加样本血清后，挑取适量鲜卵或干卵（约100～150个，从感染动物肝分离），覆盖24×24mm盖片，四周用石蜡密封，37℃保温48小时后，低倍镜观察结果，必要时需观察72小时的反应结果。典型的阳性反应为泡状、指状、片状或细长卷曲状的折光性沉淀物，边缘整齐，与卵壳牢固粘连。阴性反应必须观察全片；阳性者观察100个成熟卵，计环沉率及反应强度比例。环沉率是指100个成熟虫卵中出现沉淀物的虫卵数。凡环沉率≥5％者可报告为阳性，（在基本消灭和消灭血吸虫病地区环沉率≥3％者可判为阳性），1％～4％者为弱阳性。环沉率在治疗上具有参考意义。

　　2．分级强度判定

　　“－”折光淡，与虫卵似连非连；“影状”物（外形不甚规则，低倍镜下有折光，高倍镜下为颗粒状）及出现直径小于10μm的泡状沉淀物者，皆为阴性。

　　“＋”虫卵外周出现泡状沉淀物（＞10μm），累计面积小于虫卵面积的1／2；或呈指状的细长卷曲样沉淀物，不超过虫卵的长径。

　　“＋＋”虫卵外周出现泡状沉淀物的面积大于虫卵面积的1／2；或细长卷曲样沉淀相当或超过虫卵的长径。

　　“＋＋＋”虫卵外周出现泡状沉淀物的面积大于虫卵本身面积；或细长卷曲样沉淀物相当或超过虫卵长径的2倍。

　　3．近年来对COPT的方法作了一些改进如①双面胶纸条法：将双面胶纸条制特定的式样作COPT，可省略蜡封片法的繁琐步骤，具有操作简易，方法规范，提高工效和避免空气污染的优点。双面胶纸条法COPT（DGS－COPT）已在现场扩大应用，今后若能将该法配套干卵，则更能提高它的应用价值；②血吸虫干卵抗原片（或膜片）环卵沉淀试验，利用环卵抗原活性物质的耐热特性，将分离的纯卵超声和热