寄生虫学实验诊断技术(3)

ml。先用冷水将重铬酸钾溶化，然后徐徐加入浓硫酸，同时用玻璃棒搅拌。

　　1．检查疟原虫

　　⑴取血与涂片：用75％酒精棉球消毒耳垂，待干后用左手拇指与食指捏着耳垂下方，并使耳垂下侧方皮肤绷紧，右手持取血针、刺破皮肤，挤出血滴。薄、厚血膜可涂制在同一张玻片上（图21－7）。

图21－7　薄厚血膜制作步骤

　　1）薄血膜制片：在载玻片1／3与2／3交界处蘸血一小滴，以一端缘光滑的载片为推片，将推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。操作时两载片间的角度为30～45℃，推动速度适宜。理想的薄血膜，应是一层均匀分布的血细胞，血细胞间无空隙且涂血膜末端呈扫帚状。

　　2）厚血膜制片：载玻片的另一端（右）1／3处蘸血一小滴（约10mm³），以推片的一角，将血滴自内向外作螺旋形摊开，使之成为直径约0.8～1cm，厚薄均匀的厚血膜。厚血膜为多层血细胞的重叠，约等于20倍薄血膜的厚度。

　　⑵固定与染色：血片必须充分晾干，否则染色时容易脱落。固定时用小玻棒蘸甲醇或无水酒精在薄血膜上轻轻抹过。如薄、厚血膜在同一玻片上，须注意切勿将固定液带到厚血膜上，因厚血膜固定之前必须先进行溶血。可用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干。在稀释各种染液和冲洗血膜时，如用缓冲液则染色效果更佳。缓冲液的配制如下：

　　磷酸氢二钠液：磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）无水0.464g或Na₂HPO₄· 2H₂O 11.867g或Na₂HPO₄ · 7H₂O17.872g或Na₂HPO₄· 2H₂O23.877g，蒸馏水1000ml。

　　M／15磷酸二氢钾液：磷酸二氢钾（Na₂HPO₄）9.073g，蒸馏水1000ml。

　　使用时将上述原液按下页表配成不同的pH缓冲液：

pH M／15KH₂PO₄（ml） M／15Na₂HPO₄（ml） 蒸馏水（ml） 6.8 4.9 5.1 90 7.0 6.3 3.7 90 7.2 7.3 2.7 90

　　染色时临时配成pH7.0或7.2的缓冲液。

　　常用的染色剂有姬氏染剂（Giemsa's　stain）、瑞氏染剂（Wright's 　stain）。

　　1）Giemsa染色法：此法染色效果良好，血膜褪色较慢，保存时间较久，但染色需时较长。

　　染液配制：姬氏染剂粉1g，甲醇50ml，纯甘油50ml。将姬氏染粉置于研钵中（最好用玛瑙研钵），加小量甘油充分研磨，加甘油再磨，直至50ml甘油加完为止，倒入棕色玻瓶中。然后分几次用少量甲醇冲洗钵中的甘油染粉，倒入玻瓶，直至50ml甲醇用完为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置65℃温箱内24小时或室温内一周过滤。

　　染色方法：用pH7.0～7.2的缓冲液，将姬氏液稀释；比例约为15～20份缓冲液加1份姬氏染液。用蜡笔划出染色范围，将稀释的姬氏染液滴于已固定的薄、厚血膜上，染色半小时（室温），再用上述缓冲液冲洗。血片晾干后镜检。

　　2）快速姬色染色法：姬氏染液1ml，加缓冲液5ml，如前法染色5分钟后用缓冲液冲洗，晾干后镜检。

　　3）Wright染色法：此法操作简便，  适用于临床诊断，但甲醇蒸发甚快，掌握不当时易在血片上发生染液沉淀，并较易褪色，保存时间不长。多用于临时性检验。

　　染液配制：瑞氏染剂粉0.1～0.5g，甲醇97ml，甘油3ml。将瑞氏染剂加入甘油中充分研磨，然后加入少量甲醇，研磨后倒入瓶内，再分几次用甲醇冲洗研钵中的甘油溶液，倒入瓶内，直至用完为止，摇匀，24小时后过滤待用。一般1、2周后再过滤。

　　染色方法：瑞氏染液含甲醇，薄血膜不需先固定；而厚血膜则需先经溶血，待血膜干后才能染色。染色前先将溶过血的厚血膜和薄血膜一起用蜡笔划好染色范围，以防滴加染液时四溢。滴染液使覆盖全部厚、薄血膜上，30秒至1分钟后用滴管加等量的蒸馏水，轻轻摇动载玻片，使蒸馏水和染液混合均匀，此时出现一层灿铜色浮膜（染色），3～5分钟后用水缓慢地从玻片一端冲洗（注意勿先倒去染液或直对血膜冲洗），晾干后镜检。

　　2．检查微丝蚴

　　⑴新鲜血片检查：晚间9时至次晨2时取血1滴滴于载玻片上，加盖片，在低倍镜下观察，发现蛇形游动的幼虫后，仍须作染色检查，以确定虫种。

　　⑵厚血膜检查：厚血膜的制作、溶血、固定与姬氏液染色同疟原虫。但需取血3滴，也可用Delafieid苏木素染色法染色。该染液的配制方法如下：

　　苏木素1g溶于纯酒精或95％酒精10ml中，加饱和硫酸铝铵（8％～10％）100ml，倒入棕色瓶中，瓶口用两层纱布扎紧，在阳光下氧化2～4周，过滤，加甘油25ml和甲醇25ml，用时稀释10倍左右。

　　已溶血、固定的厚血膜在德氏苏木素液内染10～15分钟，在1％酸酒精中分色1～2分钟，蒸馏水洗涤1～5分钟，至血膜呈蓝色，再用1％伊红染色0.5～1分钟，以水洗涤2～5分钟，晾干后镜检。

　　⑶活微丝蚴浓集法：在离心管内装蒸馏水半管，加血液10～12滴，再加生理盐水混匀，离心沉淀3分钟，取沉渣检查。或取静脉血1ml，置于盛有3.8％枸橼酸钠0.1ml的试管中，摇匀，加水9ml，俟红细胞溶化后，离心（3000rpm/min）2分钟，倒去上液，加水再离心，取沉渣镜检。

　　（三）排泄物与分泌物等的检查

　　1．痰液　痰中可能查见肺吸虫卵、溶组织内阿米巴滋养体、棘球蚴的原头蚴、粪类圆线虫幼虫、蛔蚴、钩蚴、尘螨等；卡氏肺孢子虫的包囊也可出现于痰中，但检出率很低。

　　⑴肺吸虫卵检查：可先用直接涂片法检查，如为阴性，改用浓集法集卵，以提高检出率。

　　直接涂片法：在洁净载玻片上先加1～2滴生理盐水，挑取痰液少许，最好选带铁锈色的痰，涂成痰膜，加盖片镜检。如未发现肺吸虫卵，但见有夏科－雷登晶体，提示可能是肺吸虫患者，多次涂片检查为阴性者，可改用浓集法。

　　浓集法：收集24小时痰液，置于玻璃杯中，加入等量10％NaOH溶液，用玻棒搅匀后，放入37℃温箱内，数后痰液消化成稀液状。分装于数个离心管内，以1500rpm/min离心5～10分钟，充去上清液，取沉渣滴涂片检查。

　　⑵溶组织内阿米巴大滋养体检查：取新鲜痰液作涂片。天冷时应注意镜台载玻片保温。高倍镜观察。如为阿米巴滋养体，可见其伸出伪足并作定向运动。

　　⑶上述其他的蠕虫幼虫及螨类等宜用浓集法检查。

　　2．十二指肠液和胆汁　用十二指肠引流管抽取十二指肠液及胆汁，以直接涂片法镜检；也可经离心浓集后，吸取沉渣镜检。可检查蓝氏贾第鞭毛虫滋养体、华支睾吸虫卵、肝片形吸血卵和布氏姜片虫卵等；急性阿米巴肝脓肿患者偶在胆汁中发现大滋养体。

　　检查方法：可将各部分十二指肠引流液滴于载玻片上，加盖片后直接镜检。为提高寄生虫检出率，常将各部分引流加生理盐水稀释搅抖后，分装离心管，以2000rpm/min，离心5～10分钟，吸取沉渣涂片镜检。如引流液过于粘稠，应先加10％NaOH消化后再离心。引流中的贾第虫滋养体常附着在粘液小块上，或虫体聚集成絮片状物。肝片形吸虫卵与姜片虫卵不易鉴别，但前者可出现于胆汁；而后者只见于十二指肠液中。

　　3．尿　一般先离心，后取沉渣镜检。但乳糜尿需加等量乙醚，用力振荡，使脂肪溶于乙醚。然后吸去脂肪层，离心，取沉渣镜检。

　　4．鞘膜积液　主要检查班氏微丝蚴。阴囊皮肤经碘酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜积液作直接涂片检查，也可加适量生理盐水稀释离心，取沉渣镜检。

　　5．阴道分泌物　检查阴道毛滴虫。

　　直接涂片法：用消毒棉签在受检查者