组织学研究方法(4)

图1-16小鼠肾近曲小管微绒毛冷冻蚀刻复型电镜像 ×38300
MV微绒毛 E E面，P P面（白求恩医科大学尹昕、朱秀雄教授供图）

　　冷冻割断术（freeze cracking）：是将固定组织包埋在树脂内，低温下割断，断面喷镀合金，在扫描电镜下观察断面的立体构型。该技术适于研究组织内部微细结构的相互关系，如肝细胞与肝血窦和胆小管的关系，肾小体的肾小囊与血管球的关系等（图1－17）。

图1－17 大鼠肾冷冻割断扫描电镜示肾小体
R肾小囊外表面，G血管球，T肾小管
（白求恩医科大学尹昕、朱秀雄教授供图）

　　4、电镜X－射线显微分析术X－射线显微分析术（X-ray microanalysis）是研究细胞和组织内元素的种类、分布和含量的新技术。它是利用高速电子束轰击电镜内生物标本的微小区域，使该区所含的元素发射了一定波长的X－射线，通过检测器对X－射线进行波谱或能谱分析，即可测定微区内元素的性质、含量和分布。如测定细胞内Na、K、Ca、Fe、P、Cl等及某些微量元素的含量和分布变化，探讨各种元素与细胞生理和病理的关系。

　　（九）组织培养术

　　前述几种方法都是取人体或在体（in vivo）实验动物的组织，经固定等处理后，对已死亡的组织进行观察研究的。组织培养(tissue culture)或称体外实验（in vitro）则是取活组织或活细胞在体外适宜的环境中培养成活，进行实验研究。细胞在体外生存必须具有近似体内的生存条件，如充足营养供应，合理的O₂与CO₂比例，必要的电解质和适宜的渗透压，pH值、温度和湿度等，还需防止微生物污染。组织培养的特点在于可用研究各种理化因子（温度、激素、药物、毒物等）对活细胞的直接影响，并能观察记录（摄影、录像）。组织培养与前述方法结合应用，可研究某种因素对细胞增殖、分化、代谢、运动、吞噬、分泌等影响和调节的动态过程，以及细胞病变、癌变和逆转等机理，获得在体实验难达到的研究目的。

　　组织培养用液为平衡盐水及血清（小牛血清、胎盘血清等），羊水、腹水、组织浸出液等天然培养基(natural medium)。天然培养基成分复杂，且不稳定。目前广泛应用人工合成培养基（synthetic medium）现有多种商品供应，使用方便，但常仍需补充部分血清等。若仅用合成培养基和已制备好的几种必须因子与激素，称此为无血清培养基（serum-free medium），其成分和含量均是已知的，可精细研究某种因子对细胞的生物效应。

　　组织培养的方法甚多，常用容器有凹玻片、培养皿、培养瓶、培养板、流动小室等。取组织块贴于瓶底进行培养，可观察从组织块生长迁移出的细胞。取胚胎某器官原基或器官的一部分进行培养，称器官培养（organ culture）。更精细的方法是分离和纯化组织中的某种细胞，使之贴附在瓶底形成单层细胞（图1－18），称此为细胞培养（cell culture）。首次培养的细胞，称原代培养（primary cultrue；细胞增殖而密集再传代培养，称传代培养（subculture）。经长期培养而成的细胞群体，称细胞系（cell line）；用细胞克隆（cell clone）或单细胞培养而建成的某种纯细胞群体， 称细胞株（cell strain）。它们均可在液氮内长期冻存，供随时应用。现已建成多种肿瘤细胞株，广泛用于实验研究。

图1－18 体外培养的上皮细胞在相差显微镜下的图像 （北京肿瘤研究所鄂征教授供图）

　　（十）细胞融合术

　　2个或2个以上的细胞融合成为一个细胞，称为细胞融合（cell fusion）。正常人体内也有细胞融合现象，如两性生殖细胞结合而成受精卵，多个巨噬细胞融合成一个体积很大的多核异物巨细胞。体外用人工方法使两种细胞融合，制成一种新品系的杂交细胞（hybrid cell），筛选出的此种杂交细胞有很强的生命力，增殖也很旺盛。常用的细胞融合诱导物是仙台病毒（Sendai virus）和聚乙烯二醇（polythyleneglycol,PEG）。细胞融合术是细胞遗传术、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一种重要手段，如将受抗原刺激后的小鼠脾淋巴细胞分离出来，与已建立的小鼠骨髓瘤（浆细胞瘤）细胞融合，筛选出的杂交瘤细胞可长期存活和增殖，成为制备单克隆抗体的细胞株。