组织学研究方法(3)

DNA片段即核酸探针（probe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：①利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA);②应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反意RNA探针(cDNA);③依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。cRNA和cDNA的常用标记物有³²S、³²P、³H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交和细胞原位杂交。 前者是研究遗传基因、抗原基因、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达（图1－7，1－12）。核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。

图1－12 原位杂交术光镜像

A ³²P标记胰岛素cRNA探针放射自显影显示大鼠胰岛B细胞内胰岛素mRNa ×400
B 地高辛－碱性磷酸酶标记胰岛素cRNA探针显示大鼠胰岛B细胞内胰岛素mRNA ×400
C 地高辛－碱性磷酸酶标记心钠素cRNA探针显色示体外培养的人胎儿脐静脉
内皮细胞内的心钠素mRNA ×850
（第三军医大学蔡文教授供图）

　　（七）细胞和细胞化学定量术

　　组织和细胞形态结构及其化学成分的定量研究，是以量的测定及其数据变化阐述组织和细胞的生长、分化、代谢和功能的演变以及对环境因素和致病因素的反应。生命科学的研究不断深入，定量技术的应用日益广泛并有所进展。

　　1、显微镜分光光度定量术此方法是应用显微分光光度计（microspectrophotometer）测定组织化学和免疫组织化学染色标本的反应强弱，进行化成分的定量分析的。基本原理是细胞内某种物质的含量不同，其染色反应的深浅不一，对一定波长的光吸收也就不同，即某物质的消光度与一定厚度和面积内的该物质浓度成正比。通过光电组合自动控制系统将消光度转换为电信号，即可得出光密度值（O、D值），进行定量分析比较。前述荧光素染色、酶和核酸组织化学染色、多肽和蛋白质免疫组化染色、放射自显影和原位杂交等标本，均可应用显微分光光度计做定量分析。

　　2、形态计量术 形态计量术（morphometry）是运用数学和统计学原理对组织和细胞进行二维和三维的形态测量研究，如细胞及其微细结构成分的数量、体积、表面积、周长等的相对和绝对值的测量，其中三维立体结构的研究又称体视学（stereology）。机体组织的光镜结构计量已有不少有意义的资料，如人和动物的肺泡数量和表面积，肾小体的数量和体积比，肝细胞的体积和数量，胰岛的数量及各类细胞的数量比，腺垂体各种内分泌细胞的数量比等。通过组织切片或照片（光镜和电镜）平面图像的测量，推算其立体结构数值，传统方法是将测试系统（点、线、方格等）投影或覆盖在切片上或照片上，把若干样品的平面测量数据按数学公式推算出其立体数值。目前已广泛应用图像分析仪（image analyzer）进行形态计量研究，该仪器也是光学、电子学和计算机高技术产品，它是将切片或照片图像通过摄像机显示于监示器屏幕上，并根据不同结构的颜色深浅（灰度）及各像点的大小位置，快速准确地得出所需的各种形态数据。组织化学和免疫组织化学染色标本，也可应用图像分析仪测定其光密度值，进行定量分析。

　　3、流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry,FCM）是近年建立的细胞分类和定量研究技术，它是应用流式细胞仪（或称荧光激活细胞分类器，fluroescent activated cell sorter）对单个细胞生物化学和生物物理特性进行快速定量测定的。工作原理是先分离被检细胞制成悬液，并作荧光染色或标记，使单细胞液流快速通过该仪器的激光器照射分析区，被检细胞产生的不同荧光信号转变为电脉冲，分别输入计算机内贮存，并显示于示波器屏幕上，即可获得该细胞群体中不同类型细胞的有关数据，如不同细胞的数量、荧光强度以及细胞体积、表面积和内部结构等参数；还可使细胞附有不同电荷，分类收集各种细胞，该技术的特点是速度快，精确性高，灵敏度大，已成为一种重要手段广泛用于细胞动力学、 遗传学、免疫学、肿瘤学等的研究。如细胞DNA，RNA或某种蛋白质的含量分析，单个染色体DNA含量及分选，淋巴细胞膜抗原或受体的分析及细胞亚群分选，杂交细胞等的分选等，也用于肿瘤临床诊断及疗效和预后的分析等。

　　（八）电子显微镜术

　　1、透射电镜术 透射电镜（transmission electron microscope,TEM）是以电子束穿透样品（组织的超薄切片），经聚合放大后，显像于荧光屏上进行观察和摄片的。电镜的放大倍数的分辨率比光镜大得多，放大倍数为几万至几十万倍，分辨率可达0.2nm。标本制备较光镜的更严格，新鲜组织切成小块（lmm³），用戊二醛，多聚甲醛、四氧化锇等固定，树脂包埋，以超薄切片机切成厚50～80nm的超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅等重金属电子染色后，置于电镜下观察，标本在荧光屏上呈黑白反差的结构影像。被重金属浸染呈黑色的结构，称电子密度高（electron-dense）；反之，浅染的部分称电子密度低（electron-lucent）,这种染色称正染色（positive staining）。若被染结构着色浅淡，而其周围部分染成黑,是称为负染色（negative stainning）。透射电镜的电子枪加速电压50～100kV，电子束穿透力低，近年制成加速电压500kV以上的超高压电镜，电子束穿透力很强，可观察0.5～10μm厚的切片，可观察细胞内骨架等的立体超微结构。应用电镜观察细胞化学染色标本，称电镜细胞化学术（electron microscope cytochemistry）；电镜观察免疫细胞化学染色标本，称免疫电镜术（immunoelectron microscopy）；电镜与放射自显影结合的方法称电镜放射自显影术（electron microscope autoradiography）。

　　2、扫描电镜术 扫描电镜（scanning electron microscope,SEM）是用于观察组织表面的立体结构的。组织块经固定后，置于真空镀膜仪内于燥，在标本表面先后喷镀一层碳膜和合金膜，即可置于镜下观察。扫描电镜的景深长，样品表面的金属膜可提高其导电性和图像反差，在荧光屏上扫描成像，呈现富有立体感的表面图像，如细胞表面的突起、微绒毛、纤毛及细胞的分泌与吞噬行为等（图1－13）。

图1－13大鼠分离肝巨噬细胞粘着吞噬羊红细胞扫描电镜像

M肝巨噬细胞，R羊红细胞

图1－14 冷冻蚀刻标本制备示意图

图1－15 细胞单位膜从中间层劈开示意图

　　3、冷冻蚀刻复型术和冷冻割断术

　　冷冻蚀刻复型术（tfeeze etch replica）：是在透射电镜下观察组织或细胞断裂面的金属复制膜，显示细胞微细结构的立体影像。组织块先经甘油生理盐水处理（防止形成冰晶）后投入液氮快速冷冻，在低温下用钢刀将样品劈开，形成凹凸不平的断裂面：－100℃真空下使断裂面的冰晶升华，暴露不平整表面；在断裂面上先后喷镀一层合金膜和碳膜，用次氯酸等组织腐蚀掉；将反差的凸凹不平的金属复型膜置于镜下观察（图1－14）。此项技术尤适用研究生物膜的内部结构，如从单位膜的脂质分子疏水端劈开（图1－15），经蚀刻镀膜，镜下可见质膜断裂面复型膜结构状态（图1－16），其凹凸影像恰与实物相反。