遗传病的基因诊断选择(1)

  一、直接诊断和间接诊断

　　基因诊断可分为两类：一类是直接检查致病基因本身的异常。它通常使用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以探查基因无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病；另一类是基因间接诊断。当致病基因虽然已知但其异常尚属未知时，或致病基因本身尚属未知时，也可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。连锁分析是基于紧密连锁的基因或遗传标记通常一起传给子代，因而考察相邻DNA是否传递给了子代，可以间接地判断致病基因是否传递给子代。连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMP－FLP等技术均可用于连锁分析。

　　二、基因异常与诊断方法的选用

　　各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗传病也可以有不同的基因异常，但这些异常大体可分为基因缺失和突变两大类型。后者包括单个碱基置换、微小缺失或插入。近年来不发现一些遗传病是由于基因内的三核苷酸重复顺序增加引起的，根据对基因异常类型的了解，可以采用不同的诊断方法（表13－2）。如基因缺失可用基因探针杂交，PCR扩增直接检测；点突变可用等位基因特异的ASO探针、SSCP等直接检查。一般无需对家系成员进行分析。但条件是必需知道基因异常的性质，并肯定该异常与疾病之间的关系。然而，由于许多疾病的遗传异质性，以及多数遗传的基因异常尚属未知，目前能直接诊断的病种虽日益增多，但仍然是比较有限的。

表13－2 遗传的基因诊断方法
 基因异常 方法 探针、引物或限制酶 基因缺失 基因组DNA印迹杂交

　　PCR扩增 缺失基因的探针

　　引物包括缺失或在缺失部位内 点突变 RFLP分析

　　ASO杂交

　　PCR产物的多态性分析

　　（RFLP、SSCP、DGGE） 突变导致其切点消失的限制酶

　　正常和异常的ASO探针

　　引物包括突变部位 基因已知但异常不明 基因内或旁侧序列多态性（RFLP、AMP－FLP，SSCP）连锁分析 基因内或旁侧序列探针或引物 基因未知 与疾病连锁的多态性，如SSCP、AMP－FLP连锁分析，RFLP位点单体型连锁分析 与疾病连锁的多态位点探针或引物

　　许多遗传病的基因尚未分离克隆，或基因异常尚不清楚，因此还不能根据突变的性质进行诊断。但如果通过家系分析能证明某一DNA标记（无论是等位基因还是多态性位点或片段）与致病基因连锁，则凡带有该标记的成员都可能带有致病基因，从而可作出间接的连锁分析诊断。

　　应用连锁分析诊断时应注意如下几个问题：①基因与DNA标记之间可能发生重组。因此连锁分析的准确性取决于DNA与致病基因连锁的紧密程度，连锁愈紧密，可靠性愈高，故应采用尽量靠近致病基因，即连锁紧密的标记，或采用多个遗传标记以尽可能排除重组。由于可能存在重组，连锁分析不能完全确定致病基因是否存在，而是指出存在可能性或概率的大小。如果标记距基因有5cM，即重组率为5％，则作出诊断时尚有5％误差的可能，即只有95％的把握作出肯定或否定的结论。②选用的遗传标记在人群中的杂合度。如果标记的杂合度在人群中很低，即多数个体为纯合子，则这种标记用处不大。因为如家系中关键成员不能提供致病基因在哪一条染色体上的信息，常使连锁分析无法进行，因此需选用人群中杂合度高的标记。③在连锁分析时，有时只分析一个多态位点还不能把某一家系中带有致病基因的染色体与正常染色体区分开来。这通常是由于关键成员如待诊者的父母是纯合子，不能提供必要的信息，这时可同时分析更多的多态位点，即作单倍型（haplotype）分析。单倍型是指一条染色体上两个或两个以上多态位点的状态的组合。两条染色体多个位点上都纯合的概率毕竟是很小的，因此单倍型有助于区分两条常染色体，并追踪致病基因的分离情况。

　　三、遗传病的基因诊断举例

　　1．基因缺失型遗传的诊断

　　（1）α地贫的基因诊断：α地贫主要是由于基因缺失引起的，缺失的基因可以由1－4个。正常基因组用BamHⅠ切割，可以得到一个14kb的片段，而缺失一个α基因时切点向5’端移位，得到一条10kb的片段。因此，当用α基因探针与基因组DNA进行Southern杂交时（图13－8），在α地贫2可见一条14kb和一条10kb的带，在正常人可见一条双份的14kb的带，而在α地贫1则见一条单拷贝的14kb带，血红蛋白H病时只有一条10kb的带的，而在Barts水肿胎时，则无任何杂交带。

图13－8 α地贫基因缺失的诊断