第七章 细菌检查方法与防治
致病菌能引起多种感染和传染病，其诊断除可根据临床症状、体征和一般检验外，采取合适的临床标本进行细菌学和血清学检验，在确诊病因上极为重要。
获得性免疫的产生，可通过患病、隐性感染、预防接种、注射抗毒素等方式。
人工免疫是采用人工方法，将疫苗、类毒素等或含有某种特异性抗体、细胞免疫制剂等接种于人体，以增强宿主体的抗病能力。用于人工免疫的免疫原（疫苗、类毒素等）、免疫血清、细胞制剂，以及诊断制剂（结核菌素、诊断血清、诊断菌液等）的生物性制剂统称为生物制品（bioproduct）。
第一节 细菌学诊断
标本采集与送检过程是否符合下列几个原则，将直接影响到致病菌检出的成败。
1．采取标本时应注意无菌操作，尽量避免杂菌污染。
2．根据致病菌在患者不同病期的体内分布和排出部位，采取不同标本。例如流行性脑膜炎病人取脑脊液、血液或出血瘀斑；伤寒病人在病程1～2周内取血液，2～3周时取粪便。
3．采集标本应在使用抗菌药物之前，否则这种标本在分离培养时要加入药物拮抗剂。使用青霉素的加青霉素酶、磺胺药的加对氨苯甲酸。又采取局部病变标本处，不可用消毒剂，必要时宜以无菌生理盐水冲洗，拭干后再取材。
4．尽可能采集病变明显部位的材料。例如菌痢患者取其沾有脓血或粘液的粪便，肺结核病人取其干酪样痰液等。
5．标本必须新鲜，采集后尽快送检。
6．送检过程中，除不耐寒冷的脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等要保暖外，多数菌可冷藏送运。粪便标本中含杂菌多，常置于甘油缓冲盐水保存液中。
二、致病菌的检验程序
主要有直接涂片镜检、分离培养、生化试验、血清学等试验等。有的尚需作动物试验、药物敏感试验等。近年来发展的细菌学快速检验技术尚有气相色谱、核酸杂交和多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）等技术。
直接涂片检查凡在形态和染色性上具有特征的致病菌，直接涂片染色后镜检有助于初步诊断。例如痰中查见抗酸性细长杆菌，脓液中发现革兰阳性葡萄串状球菌，或咽喉假膜中有异染颗粒的棒状杆菌时，可分别初步诊断为结核分枝杆菌、葡萄球菌或白喉棒状杆菌。在某些情况下，也可在直接涂片后，以特异性荧光抗体染色在荧光显微镜下观察，若出现有发荧光的菌体就是欲检验的细菌。例如粪便中的志贺菌、霍乱弧菌等可用此技术快速检出。
分离培养原则上所有标本均应作分离培养，以获得纯培养后进一步鉴定。原为无菌部位采取的血液、脑脊液等标本，可直接接种至营养丰富的液体或固体培养基。从正常菌群存在部位采取的标本，应接种至选择或鉴别培养基。接种后放37℃孵育，一般经16～20h大多可生长茂盛或形成菌落。少数如布鲁菌、结核分枝杆菌生长缓慢，分别需经3～4周和4～8周才长成可见菌落。分离培养的阳性率要比直接涂片镜检高，但需时较久。因此，遇白喉等急性传染病时，可根据病人临床表现和直接涂片镜检结果作出初步诊断并及时治疗；不必等待培养报告，以免贻误治疗时间。
生化试验细菌的代谢活动依靠系列酶的催化作用，不同致病菌具有不同的酶系，故其代谢产物不尽相同，籍此可对一些致病菌进行鉴别。例如肠道杆菌种类很多，形态、染色性基本相同，菌落亦类似。但它们的糖类和蛋白质的分解产物不完全一样，因而可利用不同基质进行生化试验予以区别之。现已有多种微量、快速、半自动或自动的细菌生化反应试剂条（板）和检测仪器研制成功，并有商品供应。
血清学试验采用含有已知特异抗体的免疫血清与分离培养出的未知纯种细菌进行血清学试验，可以确定致病菌的种或型。常用方法是玻片凝集试验，在数分钟内就能得出结果。免疫荧光、协同凝集、对流免疫电泳、酶免疫、间接血凝、乳胶凝集等试验可快速、灵敏地检测标本中的微量致病菌特异抗原。这些方法的另一优点是即使患者已用抗生素等药物治疗，标本中的病菌被抑制或杀死培养不成功时，其特异抗原仍可检出，有助于确定病因。
动物试验主要用于分离、鉴定致病菌，测定菌株产毒性等。常用实验动物有小鼠、豚鼠和家兔等。应按实验要求，选用一定的体重和年龄，具有高度易感性的健康动物。接种途径有皮内、皮下、腹腔、肌肉、静脉、脑内和灌胃等。接种后应仔细观察动物的食量、精神状态和局部变化，有时尚要测定体重、体温和血液等指标。若死亡应立即解剖，检查病变，或进一步作分离培养，证实由何病菌所致。含杂菌多的标本，也可通过接种易感动物获得纯培养，达到分离致病菌的目的，例如将疑患肺炎链球菌性肺炎病人痰接种至小鼠腹腔。测试细菌的产毒性，可用家兔或豚鼠皮肤检测白喉棒状杆菌是否产生白喉毒素；家兔结扎肠段测定大肠埃希菌不耐热肠毒素等。目前，多数细菌的外毒素可用ELISA法测定；志贺毒素等可用Vero细胞等测定其毒性。又细菌热原质过去用家兔来检测，现已为鲎（limulus）试验替代。
药物敏感试验药敏试验对指导临床选择用药，及时控制感染有重要意义。方法有纸碟法、小杯法、凹孔法和试管法等，以单片纸碟法和试管稀释法常用。纸碟法是根据抑菌圈有无、大小来判定试验菌对该抗菌药物耐药或敏感。试管法是以抗菌药物的最高稀释度仍能抑制细菌生长管为终点，该管含药浓度即为试验菌株的敏感度。
分子生物学技术近年来应用核酸杂交和PCR技术检测致病微生物核酸是临床诊断学的重大发展。
1．核酸杂交技术原理是应用放射性核素或生物素、地高辛苷原、辣根过氧化物酶等非放射性物质标记的已知序列核酸单链作为探针，在一定条件下，按照碱基互补原则与待测标本的核酸单链退火形成双链杂交体。然后，通过杂交信号的检测，鉴定血清、尿、粪或活检组织等中有无相应的病原体基因及其分子大小。
核酸杂交技术有液相与固相之分。固相核酸杂交较常用，有原位杂交、斑点杂交、Southern印迹、Northern印迹等。核酸杂交可从标本中直接检出病原体，不受标本中的杂质干扰，对尚不能或难分离培养的病原体尤为适用。用核酸杂交技术来检测细菌感染中的致病菌，有结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希菌等。
2．PCR技术是一种无细胞的分子克隆技术，能在体外经数小时的处理即可扩增成上百万个同一基因分子。PCR技术的基本步骤为从标本中提取DNA作为扩增模板；选用一对特异寡核苷酸作为引物，经不同温度的变性、退火、延伸等使之扩增；扩增产物作溴乙锭染色的凝胶电泳，紫外线灯下观察特定碱基对数的DNA片段；出现橙红色电泳条带者为阳性。若需进一步鉴定，可将凝胶中分离的PCR产物回收，再用特异探针确定。
PCR技术具有快速、灵敏和特异性强等特点,现已用于生物医学中的多个领域。在细菌学方面，可用PCR技术检测标本中的结核分枝杆菌、淋病奈瑟菌、肠产毒素型大肠埃希菌、军团菌等中的特异性DNA片段。
其他有用气相色谱法检测细菌在代谢过程中产生的挥发性脂肪酸谱，来诊断厌氧菌感染；葡萄球菌、伤寒沙门菌、志贺菌等可用型特异噬菌体进行分型，以追踪传染源；细菌素分型，以及质粒指纹图谱分析（plsmid fingerprinting）等，主要用于流行病学等调查。
第二节 血清学诊断
人体受致病菌感染后，其免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异性抗体。抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价（titer）或称滴度的升高。因此，用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应特异抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。一般采取病人的血清进行试验,故这类方法通常称为血清学诊断（serological diagnosis）。血清学诊断主要适用于抗原性较强的致病菌和病程较长的感染性疾病。
机体血清中出现某种抗体，除患与该抗体相应的疾病外，亦可因曾受该菌隐性感染或近期预防接种所致。因此必须有抗体效价明显高于正常人的水平或随病程递增才有诊断价值。血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清标本，当后者的抗体效价比前者升高≥4倍者方有意义。若病人在疾病早期即用抗菌药物，病菌在体内繁殖不多，抗体增长可以不明显。所以，细菌学检查和血清学诊断两者在细菌感染的确立方面是互为辅助的。
常用于细菌性感染的血清学诊断种类有直接凝集试验（伤寒、副伤寒的肥达试验，立克次体的外斐试验等，钩端螺旋体病的显微镜凝集试验等）；乳胶凝集试验（检测脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌等抗体）；沉淀试验（梅毒的VDRL、RPR试验等）；补体结合试验（检测Q热柯克斯体等抗体）；中和试验（风湿病的抗O试验等）和ELISA等。ELISA技术已广泛使用于多种病原体特异性抗体的检测。由于其特异、灵敏、快速，且可自动化检测大量标本，有逐渐替代其他血清学诊断方法之势。
第三节 人工主动免疫
人工主动免疫（artificial active immunity）是将疫苗（vaccine）或类毒素接种于人体，使机体产生获得性免疫力的一种防治微生物感染的措施，主要用于预防。
死疫苗 选用免疫原性强的细菌，经人工大量培养后，用理化方法杀死而成。常用的有伤寒、霍乱、百日咳、流行性脑膜炎、钩端螺旋体病、斑疹伤寒等。死疫苗的优点是易于保存，一般4℃1年左右。缺点是接种剂量大，注射的局部和全身性副反应较大，且需接种多次。为减少接种手续，可将不同种类的死疫苗适当混合组成联合疫苗，例如伤寒和副伤寒甲、乙混合的三联疫苗，多个型别钩端螺旋体组成的多价钩端螺旋体疫苗等。
活疫苗用减毒或无毒力的活病原体制成。活疫苗的菌株可以从自然界发掘，或通过人工培育筛选。前者有鼠疫耶氏菌低毒株，后者如牛分枝杆菌在人工培养基上经13年230次移种后获得的卡介苗（BCG）。活疫苗接种后，减毒或无毒菌仍可在宿主体内有一定的生长繁殖，犹如轻型或隐性感染。一般只需接种一次，剂量较小，副反应轻微或无；而免疫效果优于死疫苗，因能同时产生细胞免疫和体液免疫两种应答，而死疫苗只产生体液免疫应答；且免疫较持久。活疫苗若以自然感染途径接种，尚有SIgA抗体的局部粘膜免疫形成。活疫苗的缺点是需冷藏保存，且保存期短，但此不足可用冻干法改进剂型来克服。
类毒素细菌外毒素经0.3%～0.4%甲醛液作用3～4周后，毒性消失但仍保持免疫原性。这种类毒素中加入适量磷酸铝或氢氧化铝等吸附型佐剂，就成为精致吸附类毒素。它们在机体内吸收缓慢、能较长时间刺激机体以增强免疫效果。常用的有白喉、破伤风等类毒素。儿童用的白百破三联疫苗是将百日咳鲍特菌与白喉、破伤风两种类毒素混合而成。优点是不仅可减少接种次数，且百日咳鲍特菌尚有佐剂作用，能增强白喉和破伤风类毒素的免疫效果。
亚单位疫苗根据细菌抗原分析，查明不同致病菌的主要保护性免疫原存在的组分，然后将之制成的疫苗称为亚单位疫苗。例如肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌是荚膜多糖，钩端螺旋体是外膜蛋白等。然后采用化学方法将这些免疫原物质予以抽取、纯化；亦可通过基因工程生产。荚膜多糖疫苗的免疫原性较弱，需加用佐剂；亦可与破伤风类毒素等结合成偶联疫苗（conjugated vaccine）,以增强多糖免疫原的应答反应。
DNA重组疫苗通过DNA重组技术制备所需的疫苗。例如福氏志贺菌2a株与大肠埃希菌MH株的杂交株疫苗，带有宋内志贺菌表面抗原质粒的伤寒沙门菌Ty21a重组疫苗等。
核酸疫苗或称DNA疫苗、基因疫苗，是将能编码引起保护性免疫应答的病原体免疫原基因片段和质粒载体直接注射入宿主体以表达目的免疫原，进而诱出保护性体液抗体和以特异性CTL为代表的保护性细胞免疫的新型疫苗。自1993年初次报道流感病毒核酸疫苗以来，已在多种细菌、病毒、原虫等病原体中研制核酸疫苗，并均获得可喜结果。因此，核酸疫苗的问世被誉为疫苗学中的一次革命。核酸疫苗具有外源基因直接在宿主体细胞内完成表达和后加工，能完整的保留产物的天然结构和免疫原性；能同时诱生机体的体液免疫和细胞免疫；若选择目的基因合适，可诱发异源性保护免疫；可大量制备，且成本低廉等优点。目前，学者们对核酸疫苗的确切作用机制，以及接种人体的安全性等问题正在继续深入研究之中。
治疗性免疫近年许多临床试验表明，相应的病原体疫苗对结核病、单纯疱疹、乙型肝炎、利什曼病等慢性复发性感染患者可增强其免疫应答，显示不同程度的疗效。这主要是疫苗可与药物起协同作用，促进患者的康复。当今，有不少研究机构和生产单位正从事这一新领域的开拓性研究。
第四节 人工被动免疫
当宿主体已受感染，采用人工主动免疫已为时过晚，此时宜行人工被动免疫（artificial passive immunization）。人工被动免疫是注射含有特异性抗体的免疫血清或纯化免疫球蛋白抗体，或细胞因子等细胞免疫制剂，使机体即刻获得特异性免疫，因而作用及时。但这些免疫物质不是病人自己产生，故维持时间短。人工被动免疫主要用于治疗或紧急预防。
抗毒素一般用细菌类毒素或外毒素多次免疫马匹，待马匹产生高效价抗毒素后采血，分离出血清，提取其免疫球蛋白精制成抗毒素制剂。抗毒素能中和相应外毒素。目前我国的白喉和破伤风的抗毒素均用马来制造，因而使用这种异种抗毒素时应注意I型超敏反应问题。
抗菌血清过去曾用于治疗的抗菌血清有抗肺炎链球菌、鼠疫耶氏菌、炭疽芽胞杆菌、百日咳鲍特菌等免疫血清。自磺胺药和抗生素等抗菌药物问世后，因抗菌血清制备较繁、菌型又复杂，以及异种血清可能引起超敏反应等，目前已基本淘汰。只是某些多重耐药菌，例如铜绿假单胞菌感染时，仍可考虑抗菌血清治疗。
胎盘球蛋白、丙种球蛋白胎盘球蛋白是从健康产妇的胎盘和婴儿脐带血中提制而成，主要含有丙种球蛋白。从胎盘球蛋白提出的丙种球蛋白，称为胎盘丙种球蛋白；若从正常成人血清中提取的称为人血清丙种球蛋白。因大多成人经历常见消化道和呼吸道传播致病菌的隐性感染，有的曾患过某些传染病，故其血清（或胎盘）中可含有多种病原体抗体。这种制剂源自人血清球蛋白，对病人虽有同种抗原问题存在，但由于免疫原性较弱，一般不会发生超敏反应。胎盘球蛋白主要用于麻疹、甲型肝炎、脊髓灰质炎等病毒性疾病的紧急预防，也可治疗丙种球蛋白缺乏症患者以预防常见致病菌的感染。因这类制剂不是专门制备针对某一特定病原体的特异抗体，故其免疫效果不如高效价的特异免疫球蛋白抗体。
细胞免疫制剂参与细胞免疫的有关细胞和细胞因子较多，相互间的调控关系复杂。因此，细胞免疫制剂在抗菌感染免疫中的应用不多；而主要试用于一些病毒性疾病和肿瘤中，例如转移因子（transfer factor,TF）、干扰素、IL-2、LAK细胞（lymphokine-activated cell）等。