概述
免疫毒理学概念：
免疫毒理学（immunotoxico1ogy）是毒理学与免疫学间的边缘学科，也是毒理学的一个新分支。它主要研究外源化学物和物理因素对机体免疫系统的有害作用及其机制。免疫毒理学是在免疫学和毒理学的基础上发展起来的，是一门十分年轻的学科。
免疫毒理学的研究内容：
免疫毒性及作用机制研究：采用各种有效的研究手段，从整体、器官、细胞和分子等不同水平研究外源化学物和物理因素对人和实验动物的免疫损害，包括免疫抑制、超敏反应和自身免疫反应，并分析其作用机制。
免疫毒性评价的方法学研究：改进、规范和完善已有的免疫毒理学试验方法，探索更灵敏、特异，更有预测价值的新方法和更全面合理的试验组合，提高试验的可靠性和效能。
免疫毒性的危险度评价：研究适合用于人群危险度评价的免疫毒性试验的观察终点，实验动物和人群免疫毒性的剂量反应规律和特性，建立合理的外推模型，分析免疫毒性的人群易感性和不同免疫危害的可接受危险度水平等。
免疫系统对外源化学物的毒性反应与机制
免疫抑制：
免疫系统的主要功能是识别并清除入侵的病源体及其产生的毒素和体内产生的早期肿瘤细胞，保持机体内环境稳定。外源化学物和物理因素可以直接损伤免疫细胞的结构和功能，影响免疫分子的合成、释放和生物活性，或通过干扰神经内分泌网络等间接作用，使免疫系统对抗原产生不适当的应答，即过高或过低的应答，或对自身抗原的应答都会导致免疫病理过程，发展为免疫性疾病。应答过低可引起免疫抑制（immunosuppression），使宿主对病源体或肿瘤的易感性增加，严重时表现为免疫缺陷；
外源化学物免疫抑制的主要表现：
很多外来化合物可对机体的免疫功能产生抑制作用，包括体液免疫功能和细胞免疫功能，抑制程度取决于接触的剂量。如苯并（a）芘、多氯联苯（PCB）、多溴联苯等。机体在接触外来化合物后，可以改变其对细菌、病毒、寄生虫以及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力，通常由于细胞介导免疫或体液免疫严重抑制而造成宿主对一些感染因子敏感性增加，抵抗力下降。如动物接触臭氧、二氧化硫、二氧化氮、光化学烟雾、汽车废气、铅尘、氧化镍等外来化合物会造成肺部防御能力受损，表现在死亡率和杀死细菌率、细菌的繁殖及侵入血循环等方面的变化。
引起免疫抑制的外源化学物：
可以引起免疫抑制的外源化学物种类繁多，目前研究较充分、结论比较肯定的有上百种。常见的免疫抑制因子见表12－1。
外源化学物免疫抑制的机制：
总的来说可以分为直接作用的间接作用两大类。外源化学物可以直接作用于不同的免疫器官、免疫细胞和免疫分子，影响正常的免疫应答，也可以通过影响神经内分泌系统的调节功能，造成免疫功能紊乱，或者继发于其他靶器官毒性而引起免疫损伤（见表12－2）。特别应该强调的是，近年来发展免疫系统不是单独发挥作用的，而是与神经系统和内分泌系统相互联系、相互作用、相互调节，构成维持机体自身稳态的复杂网络，这对于发挥免疫系统正常的功能具有十分重要的意义。
超敏反应：
也称过敏反应或变态反应，是机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时发生的一种以生理功能紊乱和组织损伤为主的异常的免疫应答。引起变态反应性病变的抗原物质称为变应原或过敏原。变应原可能是完全抗原，如异种血清蛋白质、微生物、霉菌、植物、花粉、皮片、尘螨等；也可是半抗原，即许多分子量较小的外来化合物如三硝基氯苯、氯化苦、镍和铂等某些金属、工业化学物氯乙烯等，它们本身没有抗原性，但当它们与某些蛋白质结合后就能起到抗原作用，毒物与蛋白结合的能力与该物质化学结构中的某些活性基团有密切关系。
化学物质引起的过敏反应有以下几个特点：①反应表现不同于该物质的一般毒性反应，组织病变不同于该物质的中毒变化，而是变态反应性炎症；②初次接触某种化学物质后经过1～2周，再次接触同一物质，反应即可出现；③不完全遵循毒理学的剂量—反应规律，很小的剂量进入机体即可致敏，再接触小量即可出现症状。
超敏反应的类型：
根据过敏反应出现的快慢和抗体是否存在，可将变态反应分为四型：一型是抗原进入机体后，反应即刻出现，称为速发型变态反应；另一型是抗原进入机体后1～2天反应才出现，称为迟发型变态反应，此种类型反应与致敏的淋巴细胞有关。另外还有两个中间型。
1．第Ⅰ型：速发型或反应素型Ⅰ型变态反应是IgE介导的变态反应。其发生过程是当过敏体质的机体，初次接触过敏原后，可产生IgE 抗体，凭籍IgE Fc段，抗体结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面，使机体产生致敏状态，可维持半年至数年。当致敏的机体再次接触相同的过敏原时，过敏原即与细胞表面的IgE 结合，使细胞脱颗粒，并释放多种药理活性物质，引起毛细血管扩张、通透性增加、腺体分泌增多及平滑肌收缩为特点的病理变化。如果这种作用发生在支气管则产生支气管哮喘；如作用于皮肤可出现红肿、寻麻疹等；如作用于胃肠道则出现呕吐、腹痛、腹泻等症状。
引起Ⅰ型变态反应的过敏原很多，除常见的花粉、霉菌、动物皮片、灰尘和食物外，许多化学物质如间苯二酚、甲醛、甲苯二氰酸酯、氯化苦、某些有机氯的化合物（如六六六、DDT）和铂盐、镍盐等金属化合物。
2．第Ⅱ型：细胞毒型或溶细胞型Ⅱ型变态反应是抗体（IgG或IgM）引起带抗原的组织细胞的损伤或功能障碍。IgG或IgM抗体与机体细胞（靶细胞）表面的抗原结合，通过活化补体、巨噬细胞吞噬或K细胞的抗体依赖细胞毒作用引起细胞的破坏死亡。
常见的靶细胞有红细胞、粒细胞、血小板、肾小球血管基底膜、肝细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞以及一些内分泌细胞等。长期接触铅的工人以及慢性苯中毒患者和苯接触工人可发生溶血性贫血、白细胞减少症或血小板减少性紫癜。
3．第Ⅲ型：免疫复合物型Ⅲ型变态反应是由于抗原抗体复合物在组织中沉积而引起的炎症反应。炎症反应涉及补体的活化和嗜中性粒细胞的浸润，释放出许多水解酶并造成组织损伤。
目前有资料表明，一些毒物如汞、铅、铋、铀、金等化合物可使肾细胞发生改变，引起免疫反应，造成过敏性肾病综合征。接触高浓度氯乙烯工人也可以产生免疫复合物，这些免疫复合物可能是氯乙烯产生毒性反应的机理。
有些超敏性肺炎如“农民肺”也属于这一类型。患者死亡后肺组织免疫荧光研究表明，有免疫球蛋白的沉积和补体的沉积，因此可被视为免疫复合物病。根据不同的工作种类和不同的有机粉尘尚可发生一系列类似的肺部疾患，如“蔗糖肺”、“蘑菇工人肺”、“麦芽工人肺”、“纸浆工人肺”等。临床表现为咳喘，主要在小支气管肺泡壁形成免疫复合物，吞噬细胞对复合物吞噬并有水解酶释出，引起组织水肿、出血、坏死，形成肉芽肿。
4．第Ⅳ型：迟发型或细胞免疫型Ⅳ型变态反应是由免疫的TD细胞与特异抗原的反应而引起组织损伤。表面具有特异性受体的致敏淋巴细胞再次与抗原相遇，引起细胞增殖，并释放淋巴因子，吸引和激活非特异性的巨噬细胞。由于细胞的增殖和浸润，可诱发迟发型变态反应。
有许多化学物质引起的迟发型变态反应，表现为接触性皮炎与湿疹，这类职业性皮炎约占整个职业性皮炎的60%。引起这类皮肤病的化学物质有镍、铬、砷、汞、松节油、润滑油、硝基萘及苯胺染料、甲醛、鞣酸、二硝基氯苯、重铬酸盐、环氧树脂、酚醛树脂等。
这类皮炎发生的机理是这些化学物质与表皮角质蛋白结合后，皮肤脂质作佐剂，使T淋巴细胞母细胞化，并在淋巴结和脾脏中增殖，这些致敏的淋巴细胞再回到血循环中，当再次接触相同致敏原，经过24小时后，可发生急性皮炎，48至96小时达到高峰。临床表现为局部皮肤发红、出现硬结和水泡。转为慢性时，局部出现湿疹及明显的苔癣样变。
铍病可出现慢性肺部肉芽肿、间质性肺炎、过敏性皮炎。接触少量铍即可发病，其临床表现与剂量无明显关系。铍中毒时可见血清丙种球蛋白含量增高，皮肤斑贴试验阳性，说明发生了迟发型变态反应。
（二）引起超敏反应的外源化学物：
引起超敏反应的外源化学物或混合物至少有上百种，可以来自食物、药物，也可以从职业或生活环境中接触。见表12－4。
（三）外源化学物超敏反应的表现：
超敏反应是危害人类健康的重要疾病之一，影响的人群非常巨大。据估计，美国至少3500万人患有超敏反应性疾病，其中2％－5％由职业性接触引起。职业接触外源化学物引起的超敏反应，最主要的表现为接触性皮炎和过敏性哮喘。
（四）外源化学物引起超敏反应的机制：
目前关于外源化学物引起超敏反应机制的研究资料较少，远不如对免疫抑制机制的认识。外源化学物获得抗原性后可以通过上述4种不同的反应机制引起各种超敏反应。致敏性外源化学物可能因为有些结构上的特性使他们更容易与蛋白结合，另一种可能是有的外源化学物可以调节机体识别、处理抗原的能力或免疫应答的强度，使机体处在高敏感性状态，可以对更多的物质过敏或使超敏反应的强度增加。
自身免疫：
自身免疫是指机体免疫系统对自身成分发生免疫应答的现象，自身免疫性疾病是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病。
（一）自身免疫的表现：
自身免疫是自身免疫疾病的先决条件，但发生自身免疫反应并不意味着出现疾病状态，引起自身免疫性疾病还有其他许多相关因素。自身免疫病的本质属于超敏反应，与超敏反应的区别在于诱发自身免疫病的抗原来源于自身细胞或组织，并有明显的遗传倾向。自身免疫性疾病的临床表现很复杂，可分为器官特异性和器官非特异性两大类。自身免疫性疾病以女性为多见，女性的发病率大约是男性的2.7倍。
（二）引起自身免疫的外源化学物：
很多能诱发超敏反应的外源化学物都可以引起自身免疫，其中许多是药物。见表12－5。
（三）外源化学引起自身免疫的机制：
外源化学物引起自身免疫的机制尚不清楚。关于外来化合物引起自身免疫反应和自身免疾病，其基本病理特征为化学物质作为自身抗原，刺激机体免疫活性细胞，特别是辅助T细胞，进而激活B细胞，产生一种或多种抗自身抗体，与靶部位的自身抗原结合，形成抗原抗体复合物，导致相应的组织或器官发生结构改变和功能障碍。如氯化汞引起的自身免疫性肾炎，可见染毒鼠血清IgE 和IgG浓度显著升高，T细胞依赖性淋巴结（PLN）明显增大，脾脏 IgG 分泌细胞增多，血清抗核抗体（ANA）、抗DNA抗体和抗肾小球基底膜（GBM）抗体阳性，病理切片可见肾小球基底膜和外周血管有线状或颗粒状免疫复合物沉积。
免疫毒性检测方案
由于免疫系统组成和功能的高度复杂性，以及免疫毒物作用的靶细胞和靶分子的多样性，目前还没有一种免疫毒理学试验方法能够全面地反映外源化学物对整个免疫系统的影响，因此一般采用一组免疫毒性试验的方法。不同的国家和组织分别设计了各自的试验组合，包括动物免疫毒性检测方案和人群免疫毒性检测方案。
美国食品与药品管理局（FDA）及其药品评价和研究中心（CDER）于2002年10月正式公布了新药研究中的免疫毒理学评价规范。提出要考虑药物对免疫系统五个方面的影响，除了免疫抑制、超敏反应和自身免疫外，还有免疫原性（immunogenecity）和不良免疫刺激（adverse immunostimulation），前者指药物及其代谢产物引起免疫反应的能力，后者指药物对免疫系统某些成分的任何抗原非特异性的、不适当的或难以控制的活化作用。
一、免疫抑制：
所有药物都要考虑其对免疫系统的影响。最常用的是检测药物对T细胞依赖抗原的反应，如抗绵羊红
细胞（SRBC）初级抗体（IgM）反应和次级抗体（IgG）反应（溶血空斑试验）。也可用酶联免疫吸附试验（ELISA）或酶联免疫印迹（ELISPOT）进行抗体和抗体细胞的定量。其他还可以进行NK细胞功能试验、体外淋巴细胞增殖试验、细胞毒T细胞功能试验、细胞因子和趋化因子生成试验、迟发型超敏反应以及宿主抗感染和抗移植瘤试验等。
二、免疫原性：
指药物及其代谢产物引起免疫应答的能力。药物的免疫原性要考虑药物过敏和抗药免疫反应两个方面。临床前研究预测药物的致敏作用比较困难，因为虽然免疫原性是蛋白致敏源的重要特性，但有免疫原性的蛋白性或多肽并不一定是致敏源，而且有些对实验动物致敏的药物对人并不致敏。抗药免疫反应是指药物引起的免疫反应改变了药物的生物学特性，如药效学、药代动力学和毒性。因此，在非临床研究中发现的药效学和药代动力学参数可能并不真正反映药物的药效和毒性。
三、超敏反应（药物过敏）：
是指药物引起的有害损害效应的抗原特异性免疫反应，主要用于小分子药物的致敏性。
（一）Ⅰ型超敏反应：
FDA／CDER规范中没有推荐具体的检测方法。一般用被动皮肤过敏试验（PCA）、主动皮肤过敏试验（ACA）和主动全身过敏试验（ASA）检查药物特异超敏反应抗体的诱导情况。但PCA或ACA中出现阳性反应，提示这些药物可能有致敏性，但阴性结果并不能排除其致敏性。因此FDA／CDER并不推荐将这些试验作为新药研究的常规试验。
（二）Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应：
目前没有标准试验方法。
（三）Ⅳ型超敏反应：
经典方法是豚鼠迟发性皮肤超敏反应（DHR），最常用的是Buecher试验（BA）和豚鼠最大值试验（GPMT）。这两种方法比较可靠，而且与人皮肤致敏试验有良好的相关性，因此用来检测局部用药的致敏性。
（四）假过敏或类过敏反应：
可由炎症或非抗原特异性的免疫反应引起，与直接组胺释放、补体激活或其他因素有关。如在动物实验中发现类过敏反应，进一步可用体外药物诱导肥大细胞组胺释放等试验以区分LgE介导的过敏反应。
四、自身免疫：
目前还没有预测药物自身免疫反应的标准方法。
五、不良免疫刺激：
指药物对免疫系统某些成分的任何抗原非特异性的、不适当的或难以控制的活化作用，可以由慢性炎症等引起。与假过敏反应有交叉，实际上两者之间没有明确的界限。有这种作用的化合物一般称为免疫刺激物，如免疫佐剂。细胞因子释放综合征是另一种不良免疫刺激，与某些单克隆抗体药物有关。
FDA新药免疫毒性评价规范的流程总结如图12－3。
免疫毒性试验方法与评价
免疫毒理学的研究方法，大致可分为免疫学方法、检测细胞因子的方法和转基因动物模型等三类。这些方法各有其优缺点，几种方法的联合应用能够更加全面的评价外源化合物的免疫毒性或了解免疫毒作用的机制。
免疫学方法：
免疫系统包括多种免疫器官、免疫组织、免疫细胞和免疫分子，它们分工协作维持复杂的免疫功能。
目前还没有一种免疫毒理学试验方法能够全面地反应外源化学物对整个免疫系统的影响，因此往往采用一组试验来观察外源化学物的免疫毒性。一些国家和有关组织先后推出各自的试验组合，包括动物免疫毒性检测方案和人群免疫毒性检测方案。各种试验组合之间大同小异，就啮齿类动物免疫毒性检测方案而言，一般都包含以下一个方面：1 免疫器官重量和组织形态学的改变；2 淋巴组织、骨髓和外周血白细胞细胞结构的定量变化；3 免疫细胞效应和调节功能的损害；4 对病原体和移植瘤的易感性增加。
（一）免疫病理学检查：
病理学检查对于评价外来化合物对免疫功能的影响十分有用。外来化合物接触实验动物后，对免疫系统的毒性作用可表现为淋巴器官重量或组织学的变化、淋巴组织及骨髓的细胞量或质的变化和外周血淋巴细胞数改变。因此为了观察化学物质对免疫功能的影响，首先可对免疫器官进行大体解剖观察，如果发现胸腺重量下降和胸腺发生萎缩，就应着重检查细胞免疫功能；有人观察到动物接触已烯雌酚、TCDD或环磷酰胺，胸腺重量与细胞免疫功能状况呈很好的正相关。
（二）免疫功能评价：
免疫功能评价包括固有性免疫应答和适应性或获得性免疫应答的评价。固有性免疫应答主要评价NK细胞活性和巨噬细胞功能，获得性免疫应答主要评价体液免疫功能和细胞免疫功能。
1．NK细胞活性测定：主要是观察NK细胞对敏感的肿瘤细胞（小鼠NK细胞敏感的YAC－1细胞株或人NK细胞敏感的K562细胞株）的溶解作用
2．巨噬细胞功能试验巨噬细胞在免疫反应中具有很重要的作用，它不仅有非特异性吞噬功能，还参与细胞免疫和体液免疫。巨噬细胞有多种功能，例如吞噬作用、胞内杀伤、抗原摄取和处理、产生干扰素以及对感染细胞或恶变细胞的杀死和溶解作用等。
3．体液免疫功能评价：
有许多方法可用来检测体液免疫功能，包括抗体滴度、抗体形成细胞（PFC）及B细胞受体试验等。抗体形成细胞试验是一种敏感而且常用的方法。通常用的抗原有绵羊红细胞（SRBC）、牛血清白蛋白（BSA）、卵白蛋白（0valbumin）、脂多糖（LPS）等。用琼脂单向扩散法测定人血清免疫球蛋白的含量，虽不很敏感，但却是很常用的方法。
4．细胞免疫功能评价：
细胞免疫功能主要由T细胞完成，细胞免疫担负着迟发型变态反应、移植排斥、肿瘤免疫等。可用T细胞增殖试验、迟发型超敏反应（DTH）和皮肤移植排斥反应等。其中CTL、DTH和淋巴细胞增殖试验是最常用的三种方法。
5．宿主抵抗力试验：
机体在接触化学物质后，可改变其对细菌、病毒、寄生虫及可移植肿瘤和自发肿瘤的抵抗力。一般认为，B细胞缺损，机体对细菌敏感性升高；T细胞缺损，则对病毒、寄生虫、肿瘤敏感性增高。这种试验是在动物身上进行的整体试验。①肿瘤细胞攻击试验：本试验用纯系小鼠观察机体对同系基因的肿瘤细胞的抵抗力。攻击所用的肿瘤细胞量是使10%～20%正常动物发生肿瘤的量。观察指标为肿瘤发生率、死亡率、发生肿瘤的平均潜伏期、肿瘤大小、结节数目以及平均死亡时间等。②对传染源的抵抗试验：在免疫毒性试验中常用的传染源有病毒、细菌、寄生虫。实验选用传染源时需考虑以下方面，它对人类或其它动物的危险性；动物是否易感；产生的病变是否有重复性；机体防御机制中是否需要T或B细胞参与；感染过程是否易于观察。最常用的指标是死亡率。接种剂量应相当于在正常小鼠产生死亡率为10%～20%的剂量。常用的病毒有：脑炎—心肌炎病毒（EMC病毒）、单纯疱疹性病毒（HSV）、流感A型病毒（FLU病毒）等。常用的细菌有李斯特菌和绿脓杆菌。常用的寄生虫有毛线虫和疟原虫。
6．超敏反应和自身免疫反应检测：
一般用被动皮肤过敏试验（PCA）、主动皮肤过敏试验（ACA）和主动全身过敏试验（ASA）检测Ⅰ型超敏反应，但多用于检测蛋白或多肽的致敏性，而在检测小分子致敏原方面并没有得到充分验证。用小分子化学物处理后的动物血清，在PCA或ACA中出现阳性反应，提示可能有致敏性，但阴性结果并不能排除其致敏性。目前还没有预测Ⅱ、Ⅲ型超敏反应的标准试验方法。检测Ⅳ型超敏反应最常用的是Buecher试验（BA）、豚鼠最大值试验（GPMT）和豚鼠迟发性皮肤超敏反应（DHR）。这些方法比较可靠，而且与人皮肤致敏试验有良好的相关性。目前还没有预测药物自身免疫反应的标准方法。
（三）检测细胞因子的方法：
目前检测细胞因子的方法主要有生物学测定、免疫学测定、分子生物学技术和流式细胞仪等。生物学测定也叫生物活性测定，主要根据各种细胞因子的不同生物活性检测，。免疫学测定是目前使用最为广泛的方法，主要利用细胞因子蛋白或多肽的抗原性，获得特异性抗血清或单克隆抗体，利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。其中常用的有酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫试验（RIA）和免疫印迹（Immunoblot）等，尤以ELISA最为常用。流式细胞仪检测的基本原理是用荧光标记的抗细胞因子抗体标记细胞，在流式细胞仪上观察荧光染色细胞的数量、比例和荧光强度等。分子生物学方法可能比上述其他方法能够提供更多的信息，更早发现变化。
上述各种方法都有其优缺点（表12－9），没有一种是检测所有细胞因子的最佳方法。因此，理想的方法是采用两种或两种以上方法的组合试验，可以互相弥补各自的缺点。
转基因动物模型：
转基因动物在免疫毒理学中的应用可以为外源化学物的免疫毒性的检测和免疫毒作用机制研究提供重要的工具。如利用转基因技术可以建立对免疫毒物更为敏感的动物免疫，用于免疫毒性筛检和试验；通过对某个或某些目的基因的上调或下调、Knock-out或Knock-in，可以了解这些基因在免疫应答中的作用机制，或外源化学物的免疫毒作用机制等。值得注意的是，人工转入的基因产物与内源性基因产物蛋白或多肽分子可能存在差异，两者介导的免疫学效应也可能并不完全相同。因此，虽然转基因动物可以作为免疫毒性检测和机制的重要工具，但并不能替代用常规方法进行的免疫毒性试验。