卫生毒理学——第九章 发育毒性与致畸作用

概述
　　发育毒理学（developmental toxicology）主要研究外源化学物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验，其中主要为致畸试验。
　　从畸胎学到发育毒理学
　　外源化学物或其他环境因素与机体接触后，可以干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。另外，哺乳动物的性激素对生殖发育过程也具有调节作用，正常的生殖发育必须在激素调节作用下完成。所以外源化学物，一方面直接作用于生殖发育过程，同时又可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。例如，男性的睾丸萎缩和各种形式的性机能减退，女性可出现痛经、月经紊乱，甚至闭经。卵细胞的受精过程也可受到某些外源化学物的干扰，出现不孕症。此外，神经系统对内分泌功能也有调节作用，因而也可间接影响性腺功能以及生殖发育过程，即通过下丘脑-垂体-睾丸轴或下丘脑-垂体-卵巢轴两条途径作用于生殖发育过程。
　　有些外源化学物与机体接触后，还可以引起各种类型的形态和结构的异常。例如，正在发育中的精细胞可以出现形态畸形或数目变化，而畸形的精子往往也具有功能缺陷。卵细胞受到外源化学物的损害作用后，可以出现死亡或影响其正常受精过程，有时即使能受精，也可能出现胚胎死亡，有些胚胎即使能存活，其正常发育也受到干扰，以致胎 仔（儿）出现外观或功能异常。外观的异常通常称为畸形（malformation）。它是外源化学物干扰正常生育繁殖过程的一种表现，称为致畸作用（teratogenic）。
　　发育毒理学是在畸胎学基础上发展起来的毒理学分支学科。但是，畸胎学，或出生结构缺陷的研究，作为一个描述性的科学在有文字之前就已经存在了。四大文明古国都有畸胎的记载，最早可以追溯到6500D.B。那时人们相信异常的婴儿是上天的惩罚、星象的反映和未来的预兆，或者是人和动物之间杂交的结果。随着16、17世纪生物科学的兴旺发展，willian harvy于1651年提出了畸形起因于器官或结构的不完全发育的发育障碍学说，来解释除遗传起源以外的历有畸形。现代实验畸胎学开始于19世纪初，许多19和20世纪的胚胎学家，使用各种不同的物理（震动，倒置，针刺）和化学因素处理鸡蛋，产生了畸形小鸡，重要的是，他们注意到作用时间在决定畸形类型方面比损伤的性质更重要。
　　反应停（thalidomide），20世纪60年代前后在欧洲和日本广泛作为安全有效的抗早孕反应药物，口服剂量50—200mg／d。1961~1962年，联邦德国的儿科病房中出现了大量罕见的短肢畸形儿，多数为四肢缺陷、无眼、腭裂、骨骼发育不全、十二指肠和肛门闭锁。同一时期，全球出现了5850个短胶畸形儿。McBride和Lenz在德国和澳洲的独立研究，均确认反应停是其原因。反血停被迫从市场撤回，动物模型复制成功。其致畸剂量相当于1mg／（kg.d），只要末次月经后6~8周内口服200mg反应停便可引起严重的短肢畸形；服药妇女还有流产、早产和死胎等发生。反应停事件是人类历史上的一个悲剧。但由此，促进了化学致畸的研究以及管理法规的建立。在许多国家中，管理机构开始发展动物测试方法并与慢性毒性研究分开，以评估药物对妊娠的影响。1966年美国FDA提出了三段生殖毒性试验指南，包括对致畸等发育毒性的评价。但是，尽管早就提出了发育毒性的四大表现，实际研究中仍将注意力放在致畸作用上，而忽略了对其他发育毒性的评价。直到20世纪80年代后期美国环境保护局（EPA）提出可疑发育毒物危险度评价指南，第一次明确提出了对发育毒性的评价。我国每年有30—40万患严重的、肉眼可识别的先天缺陷的新生儿出生，其中很大比例在一年内死亡。先天畸形占围生期死亡原因的第二、第三位。先天缺陷导致寿命缩短是肿瘤和心血管疾病的8倍和5倍
　　发育毒性与致畸性
　　发育毒理学（developmental toxicology）是毒理学的重要分支学科，研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的发育过程中，由于出生前接触导致异常发育的理化因素或环境条件后的发病机制和结果。
　　一、基本概念
　　发育毒性（developmental toxicity）指出生前经父体和（或）母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前内出现的有害作用，包括：结构畸形、生长迟缓、功能障碍及死亡。能造成发育毒性的物质称为发育毒物（developmental toxicant）。发育毒物应是在未诱发母体毒性的剂量下产生发育毒性的物质。
　　某些外源化学物可干扰胚胎以及胎儿的发育过程，影响正常发育。具体表现可分为：
　　1．生长迟缓：即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。
　　2．致畸作用（teratogenic effect）由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现。
　　3．功能不全或异常：即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。功能不全或异常往往在出生后一定时间才被发现，因为正常情况下，有些功能在出生后一定时间才发育完全。
　　4．胚胎或胎仔致死作用：某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。具体表现为天然流产或死产、死胎率增加。在一般情况下，引起胚胎或胎仔死亡的剂量较致畸作用的剂量为高，而造成发育迟缓的剂量往往低于胚胎毒性作用剂量，但高于致畸作用的剂量。
　　以上四种发育毒性的具体表现并非一定在一种外源化学物作用下同时出现，有时只出现其中的一种或一部分。此外，有些外源化学物通过胎盘与发育中的胚胎或胎仔接触，还可以引起子代肿瘤发生率增高。
　　致畸作用是外源化学物发育毒性的一种具体表现，对存活后代机体影响较为严重，往往是一种不可逆过程，具有重要的毒理学意义，本节也将以致畸作用为重点，进行讨论。
　　畸形（malformation）器官形态的异常。
　　变异（variation）集体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即为变异。
　　畸胎（terate）具有畸形的胚胎或胎仔。
　　致畸物或致畸原（teratogen）凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。
　　致畸试验：评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。畸形时胚胎或胎儿的某些细胞在生长发育的最敏感阶段受损的结果。致畸作用是外源化学物毒性作用的一种表现。
　　先天性畸形并非一定具有遗传性，而且大多数先天畸形并不具有遗传性，但也确有一部分先天性畸形具有遗传性，可传给后代。凡由于外源化学物损伤生殖细胞所引起的先天性缺陷或异常，具有遗传性，可有亲代动物遗传给子代。如果此种损害仅涉及体细胞，与生殖无关，则所引起的先天畸形不具有遗传性。根据目前致畸试验的概念和方法，涉及范围仅限于体细胞受损所引起的畸形，即外源化学物干扰胚胎器官形成过程的结果。
　　除外源化学物具有致畸作用外，其他物理因素（如放射线）和生物因素（如风疹病毒）也可引起胎儿畸形。目前在毒理学中，主要以化学物的致畸作用作为研究对象。
　　胚胎毒性作用（embryotoxicity）外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。
　　二、发育各阶段发育毒性作用特点
　　器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感
　　具有发育毒性的外来化合物与发育中的胚胎或胎仔接触，可因胚胎或胎仔所处的发育阶段不同而呈现不同的敏感性。有性生殖动物由受精卵发育成为成熟个体的过程，可概括为胚泡形成、着床、器官发生、胎儿发育以及新生儿发育等阶段。着床前的胚胎对胚胎致死作用较为易感，对致畸作用并不如此。在胚胎发育后期和新生儿期，最容易表现的发育毒性是生长迟缓和神经、内分泌以及免疫系统机能的改变。胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽较胚胎为低，但仍有一定数目的死产胎发生。
　　在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段是器官发生期，一般称为危险期或关键期。在常用试验动物中，自受精日计算，大鼠器官发生期约为9～17天，小鼠器官发生期为7.5～16天，家兔为11～20天。在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态结构异常，但如在着床前胚泡形成阶段接触致畸物，则往往出现胚胎死亡，畸形极少。大鼠着床前胚泡形成期，自受精日计算，约为3～4天，开始着床日约为5.5～6天；小鼠分别为3～4天和4.5～5天；家兔分别为3～4天和7天。
　　同一剂量的一种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。例如，以20mg/kg体重剂量环磷酰胺在受精后第8～12天期间，每日分别给予小鼠，虽然畸形多出现于前肢趾部，但畸形种类，则可因给予的日期不同而分别为多趾，并趾，缺趾和无趾。如将大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出现骨骼畸形；如在第12天给予，则诱发腭裂。同样剂量砷酸钠在小鼠受精第7天和第9天分别给予，前者主要出现脐疝，后者主要为露脑。
　　发育中的胚胎对致畸作用的敏感期虽然主要在器官发生期，但在此期间，各种不同器官还各有特别敏感的时间。大鼠器官发生期为受精后9～17天，但眼的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为9～10天之间，脑约为10天，头与脊椎骨约为11天，腭为12～13天，泌尿生殖器官约为15天。
　　三、母体毒性与发育毒性
　　母体毒性（maternal　toxicity）是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。母体毒性作用可分为轻度和严重母体中毒。轻度母体中毒的表现应限于母体体重下降，正常增长受到抑制。抑制程度，不超过不接触受试物对照组动物的10%。肝重可略有增加，但生殖机能正常；严重母体中毒可出现体重增长大幅度抑制、持久性呕吐、过度安静或活动过度、呼吸困难、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡。
　　母体毒性作用与致畸作用关系
　　外源化学物的母体毒性作用与致畸作用的关系有下列几种：
　　1．具有致畸作用，但无母体毒性出现。表明此种外源化学物的致畸作用具有特定的作用机理，与母体毒性无关。此种受试物致畸作用往往较强，应特别注意。
　　2．出现致畸作用的同时也表现母体毒性。此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体具有损害作用，但二者并无直接联系。
　　3．不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态，以致对胚胎具有非特异性的影响，并造成畸形。
　　4．仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。
　　5．在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。
　　此种情况较为复杂，实际有两种可能:一种是受试物确实不具有致畸作用，而且也不具有母体毒性；另一种情况是动物接触的剂量未达到致畸作用的最小有作用剂量，即致畸阈剂量，并非真正不具有致畸作用。在对一种外源化学物进行致畸试验时，如未观察到致畸作用，也无母体毒性表现，应在动物可能耐受条件下，最大限度地增加剂量，使其远远高于人类实际可能接触的水平，如仍未出现致畸作用，才可做出结论。严格的概念，在一定剂量下，能引起母体毒性作用，但未观察到致畸作用，才可以认为不具有致畸作用。母体毒性致畸作用较母体毒性作用剂量为低。
　　四、发育毒性的剂量-反应模式和阈值的概念
　　1．剂量效应关系复杂的表现及原因是：
　　（1）机体在器官形成期间，与具有发育毒性的化合物接触，可以出现畸形，但也可引起胚胎致死。当剂量增加时，毒性作用增强，但二者增强程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增强更较明显，而致畸作用并不如此。由于胚胎死亡增加，畸胎数将因而减少。
　　（2）某种致畸物可以引起一定的畸形，但在同一条件下，给予更高的剂量，并不出现同一类型畸形。可能由于较高剂量往往造成较为严重的畸形，较低剂量一般引起的轻度畸形，而严重畸形有时可将轻度畸形掩盖。例如一种致畸物在低剂量时，可以诱发多趾，中等剂量时则诱发肢长骨缩短，高剂量时可造成缺肢或无肢。
　　（3）许多致畸物除具有致畸作用外，还有可能同时出现胚胎死亡和生长迟缓；而且不同表现还可以相互影响，又无一定规律。因此剂量效应关系更为复杂。
　　2．致畸作用的剂量反应曲线较为陡峭　最大无作用剂量与100%致畸剂量之间距离较小，一般相差1倍，曲线斜率也较大，亦即致畸带较为狭小。往往100%致畸剂量即可出现胚胎死亡，剂量再增加，即引起母体死亡。还有人观察到致畸作用最大无作用剂量与引起100%胚胎死亡的最低剂量仅相差2～3倍。例如剂量为5～10mg/kg体重的环磷酰胺给予受孕小鼠不表现致畸作用，但增加到40mg／kg体重，可引起100%胚胎死亡。
　　致畸物剂量与反应关系说明在致畸试验中，剂量的选择具有重要意义。因致畸试验主要观察指标为活产胎仔出生时存在的畸形，所以如果胚胎或胎仔大量死亡，则影响对致畸作用的观察，即使受试物有致畸作用，亦将被掩盖，无法被观察到。
　　3．致畸作用最大无作用剂量问题尚有不同意见：
　　一般认为机体接触低于致畸阈剂量的致畸物时，先天畸形、胚胎致死和生长迟缓发生率的自然本底质并不增高，表明这一剂量即为最大无作用剂量。但也有人认为致畸作用中的最大无作用剂量问题并无解决，主要是目前对于低剂量致畸物的作用与畸形自然发生率的本底值，尚不能明确区分。
　　掌握致畸作用中剂量与效应关系的规律，对外源化学物致畸试验中适当剂量的确定，具有重要意义。过低剂量不足以显示确实存在的致畸作用，可得出错误的结论；剂量过高可使大量胚胎死亡或对母体毒性作用过强，都可影响结果的正确性。另外，评定一种致畸物对人体危害时，应充分考虑人体可能实际接触的剂量。在致畸试验中，对此将进一步讨论。
　　致畸（发育毒性）作用机制
　　发育的特点是在大小、生物化学和生理学、形态和功能方面的变化。这些变化受到管理基因转录的因素调节，这些因素在胚胎的基因组中使调节基因活动，而且连续的基因激话作用次第持续贯穿发育。现在，细胞间和细胞内对正常发育所必要的信号传导路径已被阐明，已知它们依赖于转录、翻译，以及翻译后（如，磷酸化作用）的调控。
　　化学毒物对发育损伤的机制十分复杂，多数还不清楚。Wilsom（1977）提出了畸形发生的9种机制，包括突变、染色体断裂、有丝分裂改变、改变核酸完整性或功能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、渗透压不平衡和酶抑制作用。近年来在分子水平的研究有很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。
　　1．干扰基因表达　某些基因的表达受到抑制或异常表达可能引起畸形。如有报道在培养的小鼠胚胎中用反义寡核苷酸探针抑制原癌基因Wnt-1或Wnt-3a，都可产生中脑和后脑，或中脑、后脑和脊髓的畸形。剔除Wnt—1基因的突变小鼠也可产生中脑和后脑的畸形。反之，如向小鼠胚胎中加人鸡的β－肌动蛋白启动子时，Hox-1.1基因表达，并产生多种颅脸部和颈椎的畸形。
　　2．基因突变与染色体畸变　已发现诱变原有潜在致畸性，如电离辐射、烷化剂、亚硝酸盐、多数致癌物都可能致畸。实验证明，妊娠第13天的大鼠胚胎羊膜内注入CP及其两个代谢活化的致畸性产物PM或AC后，CP和AC引起了脑积水、露眼、腭裂、小颌畸形、脐疝、尾部和肢部缺陷；而PM仅仅引起脑积水，尾部和肢部缺陷。3H标记CP的实验显示大约87％的放射性与蛋白质结合，5％与DNA结合，8％与RNA结合。使用碱洗脱，证实CP和PM引起单链DNA断裂，以及DNA-DNA和DNA-蛋白质交联。进一步的实验证实：PM的一个单功能烷化衍生物，有能力产生单链断裂但无DNA交联作用，引起了和PM一样的效应谱；而PM的一个非烷化衍生物（CP类似物）和AC不引起DNA损伤。AC易与蛋白质结合，而PM易与DNA结合。PM和AC对培养中的肢芽有明显的不同效应。这些结果提示PM和AC在胚胎中有不同的靶，PM对CP诱导的DNA损伤有责任，而AC可能通过与蛋白质结合而致畸。
　　有报道染色体畸变占人类发育缺陷原因的3％左右。这数字可能比实际低得多，因为常染色体数目的过多或缺少常常使胚胎死亡，难以发现或未作检查。而生殖丢失占很大比例。现在，大量的研究已证实，自发流产的胚胎中至少50％存在染色体畸变（主要是不分离）。电离辐射，病毒以及能引起染色体畸变的某些化学毒物都有致畸作用。
　　3、损伤细胞和分子水平的翻译　细胞增殖对发育显然是必要的。细胞增殖率在个体发生过程中空间和时间都在变化，在胚胎中细胞增殖、分化和凋亡之间有精致的平衡。用CP处理妊娠第10天大鼠，引起胚胎的S-期细胞周期阻断，在细胞迅速增殖区域观察到细胞死亡。细胞周期长度的不同可能部分地影响敏感性。如：胚胎的神经上皮对CP诱导的细胞死亡相当敏感，而心脏有抵抗力。第10天大鼠胚胎神经上皮的细胞周期时间大约为9.5h，而在心脏中的细胞周期大约是13.4h，这是由于心脏细胞比神经上皮有更长的Go／Gl期。对DNA的损伤可在G1-s转换时、S期和G2-M转换时抑制细胞周期的进展。 CP诱导DNA损伤可导致细胞周期混乱和特定的细胞群体中的细胞死亡。如果DHA损伤被修复，细胞周期能恢复正常，但如果损伤太广泛，或细胞周期抑制太久，可能引发凋亡。在全胚胎培养中使用活化的CP也观察到相似的胚胎细胞周期阻断和细胞死亡。
　　4．细胞调亡　细胞凋亡，又叫程序性细胞死亡，指胚胎中在遗传基因的控制之下的特定类型的细胞死亡。凋亡对来自原基的结构的造型是必需的。有不少致畸物，如细胞生长依赖激素、乙醇、抗癌药物都能促进细胞凋亡。
　　在凋亡中起一定作用的基因在不断增长。p53基因，有肿瘤抑制基因的作用，能促进凋亡或生长停止。在正常的发育期间出现的凋亡不需要p53基因，例如，有p53-缺陷的胚胎能正常发育。然而，p53可能在对DNA损伤的反应中对导致生长停止或凋亡有重要作用。如，与正常纯合子（十／十）的对照相比较，在杂合子p53缺陷（P／十）妊娠小鼠的子代中，苯并[a ]芘引起的胎儿吸收和产后死亡的发病率分别增加了3倍和10倍以上。生长因子和一些细胞因子（IL-3，IL-6）能预防p53-依赖的凋亡。
　　c-myc产物的表达使DNA持续不断地合成，而面临DNA损伤时它可能促成凋亡。Bcl-2有作为凋亡的阻遏物的功能和与类似物Bax结合的功能，Bax可与它自己或与Bcl-2成为二聚物。Bax同型二聚体促成细胞死亡，Bcl-2／Bax异型二聚体抑制细胞死亡。
　　已证实，致畸因子过高热、环磷酰胺或砷酸盐处理着床后的小鼠胚胎，在一些胚芽组织中与凋亡一起导致DNA断裂、caspase-3的话化和多聚（腺甘酸二磷酸-核糖）聚合酶（PABP）的分裂。这些因子还能引起胚胎线粒体的改变而造成细胞色素C的释放，并造成caspase-3上游的活化因子caspase-9的活化。
　　5．干扰细胞　细胞交互作用反应停的代谢活化产物引起胚胎细胞的粘连受体（adhesive receptors）下调，阻碍发育过程中细胞与细胞和细胞与基质之间的相互作用，干扰了细胞之间的通讯从而导致肢芽结构异常。
　　6．通过胎盘毒性引起发育毒性　已知对卵黄囊或绒（毛）膜尿囊胎盘有毒性的毒物有46个，包括镉（Cd）砷或汞、香烟、乙醇、可卡因、内毒素和水杨酸钠等。如Cd在妊娠中晚期通过引起胎盘毒性（坏死，减少血流）和抑制对营养物质的传送导致发育毒性。
　　实验发现，在妊娠晚期大鼠体内注入Cd造成胎儿死亡，但几乎没有的进入胎儿体内，而是在10h内伴随子宫胎盘血流减少发生胎儿死亡；如胎儿直接注射Cd，尽管胎儿的Cd负荷比母体给药后高几乎10倍，胎儿死亡仅只有轻微增加。此外，Cd可在胎盘诱导金属结合蛋白（或称金属硫蛋白，MT），而MT对Zn有高亲和力，可在胎盘中结合Zn而干扰Zn转移通过胎盘。Cd的理化性质与必需元素锌（Zn）相似，可竞争性抑制人类通过胎盘微泡吸收Zn跨膜转运，以及竞争性地在胎盘中抑制其他的Zn依赖的过程。联合给予Zn可以改善Cd的发育毒性。
　　7．干扰母体稳态　二氟苯水杨酸，引起兔的中轴骨骼缺陷。其发育毒性剂量引起严重的母体贫血并损耗红细胞ATP水平。妊娠第5天给单剂量的二氟苯水杨酸引起持续到第15天的母体贫血，而这正是缺氧引起类似的中轴骨伤缺陷的关键日子，胚胎中血药浓度低于母体的血药峰水平的5％。因此，二氟苯水杨酸对兔的致畸性或许是由于母体的贫血造成缺氧的结果。
　　苯妥英在实验动物中能影响母体的叶酸代谢致畸。孕第10天，易感的A／J小鼠的心率剂量依赖性地被苯妥英降低，实验性给氧可减少小鼠中苯妥英的致畸性；而抗性的C57B1／6J小鼠心率不降低。因而认为，畸形与母体的心率降低和胚胎的缺氧有关。
　　减少子官的血流被认为是经基脲引起致畸的一种机制，它提高收缩压，改变心率，减少心输出，严重地减少子宫的血流，而且在妊娠兔中增加血管的阻力，给药后胚胎立即显示颅面和心包出血。而通过夹紧妊娠兔子宫血管10min可引起同样的胚胎异常。
　　MT合成可被包括金属、酒精、胺基甲酸乙酸、内毒素、烷化剂、高或低血糖和电离辐射等许多化学和物理因素诱导，也可被糖皮质激素和某些细胞因子等内源性调节剂诱导。MT合成的诱导可导致孕母肝MT浓度大大高于正常，降低血浆Zn浓度，进而使孕体可利用的Zn减少、Zn缺乏而导致发育毒性。这已为多种不同的化学物包括丙戊酸、6-巯基嘌呤、乌拉坦、乙醇和常春藤皂贰的实验所证实。
　　孕妇缺乏代谢前体或基质也是致畸机制之一。膳食中某些营养素缺乏，特别是维生素和无机盐类缺乏易导致生长迟缓、致畸或胚胎死亡。我国因孕期母体缺碘或新生儿期缺碘，导致的智力低下儿童近1000万。所以政府推广食用加碘盐。
　　8．内分泌干扰作用　激素具有对内环境稳定的维护和发育过程的调节作用。内分泌干扰物为干扰激素的制造、释放、传送、代谢、结合、作用或排除的外源性因子。包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂、塑化剂、表面活化剂、有机金属、卤代杂环烃、植物雌激素等。由于激素在许多组织中有指导分化的关键作用，发育中的生物体对有激素或抗激素活性的化学物尤其敏感。内分泌干扰物至少通过四种干扰内分泌系统的作用模式引起发育毒性：①作为类固醇受体的配体起作用；②改变类固醇激素代谢酶；③扰乱下丘脑。垂体激素释放；④通过目前还不清楚的模式作用。
　　典型的例子是己烯雌酚（DES），在小鼠中导致包括雄性和雌性生殖道和脑畸形的发育毒性。雌性子代出现不育，输卵管、子宫、子宫颈和阴道的结构异常和卵泡的损耗和畸形3雄性子代可表现出尿道下裂，精子形态学和运动性异常，生殖道损害（包括隐睾症和睾丸癌），不育等。在发育期暴露抗雄激素物质主要显示男性异常，包括尿道下裂，保留乳头，睾丸和副性腺重减少，精子产生减少。
　　发育毒性和致畸作用试验与评价
　　致畸作用是发育毒性中最重要的一种表现，所以外源化学物发育毒性的评定，主要是通过致畸试验。在致畸试验中除可观察到出生幼仔畸形外，也可同时发现生长发育迟缓和胚胎致死。传统常规致畸试验是评定外源化学物是否具有致畸作用的标准方法，多年来很多国家和机构都采用和推荐这一方法。
　　一、动物发育毒性试验
　　1．动物选择
　　致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。
　　根据上述原则综合考虑，致畸试验可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窝产仔8～10只，易于得到足够标本数；而且经验证明，大鼠对大多数外源化学物代谢过程，基本与人类近似，故可首先考虑。但大鼠对一般外源化学物代谢速度，往往高于小鼠和家兔，以致对化学致畸物耐受性强、易感性低，有时出现假阴性。大鼠在器官发生期初期，其胎盘具有卵黄囊，称为卵黄囊胎盘，在器官发生期后期，将转变为绒膜尿囊胎盘，有些外源化学物，例如锥虫蓝可以干扰通过卵黄囊胎盘对胚胎的正常营养过程，并因此致畸，出现阳性结果；而人类胎盘不具有卵黄囊胎盘阶段，不存在同样问题，所以有时此种结果对人类为假阳性。
　　小鼠自然畸形发生率较大鼠高，但低于家兔，对形成腭裂的致畸物更较敏感。家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期不够恒定，有时延长至36天，自然畸形发生率也较高。
　　2．剂量分组
　　由于致畸作用的剂量效应（反应）关系曲线较为陡峭，斜率较大，最大无作用剂量与引起胚胎大量死亡以及母体中毒死亡的剂量极为接近。因此在确定剂量时，一方面要求找出最大无作用剂量以及致畸阈剂量；同时还要保持母体生育能力，不致大批流产和过多胚胎死亡；较多母体死亡也应避免。
　　一般应先进行预试，预试的目的是找出引起母体中毒的剂量。
　　根据预试结果可以确定正式试验剂量。应最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。
　　一般最高剂量不超过LD50的1/5～1/3，低剂量可为1／100～1／30。这一原则在预试中也可试用。如已掌握或能估计人体实际接触量，也可将实际接触量作为低剂量，并以其10倍左右为最高剂量。凡急性毒性较强的受试物，所采用剂量应稍低，反之可较高。也有人以亚慢性毒性试验的最大无作用剂量为高剂量，并以其1／30为低剂量，可供参考。
　　每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等大动物3～4只。在一般常规试验中，除设有3个剂量组和一个对照组外，如受试物溶于某种溶剂或介质中给予动物，则另设溶剂对照组。有时为了更好地验证试验结果。另设阳性对照组，按大鼠每kg体重15 000IU维生素A剂量，或将每ml含50 000IU维生素A的浓鱼肝油，按每100g体重1 ml剂量给大鼠灌胃。此外敌枯双、五氯酚钠等也可采用。
　　致畸试验的剂量分组，可因试验目的的不同而异，如试验的主要目的是先确定受试物有无致畸作用，则组数可先对减少，但每组动物数应较多。如观察剂量－效应关系，则组数应增加。
　　3．动物交配处理
　　将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。确定受孕方法是阴栓检查或阴道涂片精子检查。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。准确确定受孕日对精确掌握动物接触受试物时间、最后处死动物及确定进行检查的日期非常重要。
　　由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。如提前在着床前接触，将影响受精卵的着床。如在胚胎发育的最初阶段，例如裂卵期和囊胚期接触受试物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官发生期以后接触受试物，则各种器官已发育成熟，致畸作用不易表现。只有器官发生期的胚胎，对致畸物最为敏感，易于出现畸形。
　　大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天开始给予受试物，每日一次，持续到第15天。如拟深入研究何种器官对受试物更为易感，则应在上述期间将受试物每日分别给予一批动物，每批动物只接触受试物一次，最后可以根据畸形出现的情况，确定受试物的主要靶器官。
　　接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况一致，一般多经口给予。也可采用灌胃方式，以保证剂量准确，效果较混入饲料喂给为好。在特殊情况下，也可采用腹腔注射法，效果与经口近似。
　　试验期间每2～3天称取母鼠体重。一方面可根据体重增长，随时调整给予受试物的剂量，同时也可观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。受孕动物的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎发育正常；如体重停止增长或下降，可能由于受试物的毒性作用或母体的其它原因，引起胚胎死亡或流产。
　　4．胎仔检查
　　自然分娩前1～2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天。
　　活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：①外观畸形肉眼检查，例如露脑；②肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；③骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。
　　以上检查只能检出结构与形态异常的畸形，不能检出可能发生的生化功能或神经行为缺陷。因此有人主张将试验雌鼠保留1/4左右，待其自然分娩，并将出生幼仔饲养观察，至少到断奶，以便检查可能存在的先天缺陷和生理功能异常。
　　二、流行病学研究和人类的证据
　　在致畸试验结果评定时，主要计算畸胎总数和畸形总数。计算畸胎总数时，每一活产幼仔出现一种或一种以上畸形均作为一个畸胎。计算畸形总数时，在同一幼仔每出现一种畸形，即作为一个畸形；如出现二种或二个畸形，则作为二个畸形计，并依此类推。计算时还要对剂量效应（反应）关系加以分析。更重要的是按下列指标将各剂量组与对照组结果进行比较。
　　活产幼仔平均畸形出现数：即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。对较为重要的畸形，还可分别单独进行计数。

　　畸形出现率：即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。

　　母体畸胎出现率：即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。计算出现畸形母体数时，同一母体无论出现多少畸形胎仔或多少种畸形，一律按一个出现畸胎的母体计算。

　　在评定试验结果和进行实验组与对照组对比时，应该按每个母体为单位，即按每窝计算。在致畸试验中，每个母体或每窝是实验单位。
　　根据上述指标，进行初步计算后，确定受试物是否具有致畸作用的最后结论时，尚需注意以下几点：
　　（１）任何结果必须通过统计计算方法进行剂量组与对照组对比；必须具有统计学意义才能认为是阳性结果。此外，还应充分注意到剂量－效应关系是否较为明显，较为明确者才可确定其致畸作用。
　　（2）应该掌握所用实验动物品系的自然畸形发生率。如出现长期以来在该品系实验动物未曾出现过的畸形，则应特别认真对待。但即是实验动物出现的重要畸形类型在该品系实验动物中过去也常出现，也不能认为此项结果不具有阳性结果的意义，轻易作出不具有致畸作用的结论。
　　（3）致畸作用中动物物种和品系差异较为显著，因此要求在两种动物进行试验。如果在一种动物观察到致畸作用，二另一种未观察到，从毒理学安全角度，可以认为该受试物仍具有潜在致畸可能性，尚需认真对待。尽量较少人类与其接触的机会。即使两种动物都未观察到致畸作用，也应对试验方法和试验过程进行认真检查，必须绝对可靠，才能作出不具有致畸作用的结论，对此应格外慎重。
　　（4）由于物种差异，对动物不具有致畸作用的外源化学物对人是否致畸的问题。即将动物试验结论推论到人，尚无理想可靠的方法。亦应格外认真对待。凡代谢情况及毒物动力学参数相近者，将动物试验结果推论到人，较为可靠。此外，还可利用流行病调查方法，进行人群调查，掌握在人群致畸作用的实际情况。在这种情况下，应特别注意人体的实际可能接触的剂量。经验表明，甚至人体需要的营养素达到一定的剂量，也呈现致畸作用，如维生素A。故考虑任何外源化学物对人体致畸作用时，必须充分考虑人体实际可能接触量与动物试验中的最小有作用剂量（即致畸阈剂量）之间的剂量距离范围。
　　致畸物以及发育毒性作用物危险度评定
　　（1）欧共体（EEC）和经济合作与发展组织（OECD）建议的致畸物分级标准。主要根据动物试验和人群调查资料，具体分级标准：
　　1级、已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷；
　　2A级、对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定因果关系；
　　2B级、动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料；
　　3级、尚无结论性肯定致畸证据或资料不足；
　　4级、动物试验阴性，人群中调查结果未发现致畸
　　（2）致畸指数：母体LD50与胎仔最小致畸作用剂量之比，即母体LD50／胎仔最小致畸作用剂量。这一比值愈大，致畸作用愈强，一般认为比值10以下者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用强烈。
　　（3）相对致畸指数（RTI）成年动物最小致死剂量（LD01）与引起5%活产胎仔出现畸形的剂量（tD05）之比值，即LD01／tD05。
　　（4）母体毒性与发育毒性比值：或称成年毒性与发育毒性比值，即对母体最低损害作用剂量（A）与胎仔最低损害作用剂景（D）之比（A／D）。一般认为A／D比值为3或3以上者，则具有发育毒性危险性。比值越大，危险性越高，3以下者，相对危险性较低或不具危险性。在一般情况下，大多数化合物A／D比值均在3以下，以及1～2范围内。关于母体和胎仔最低损害作用的具体表现，在母体主要为体重增长减少，出现某些临床症状以及死亡，对胎仔则为致畸以及其它发育毒性表现。
　　三、发育毒性的替代试验
　　用动物试验来检测、研究化学毒物的发育毒性既费钱又费时间。多年来许多研究者一直在寻求简单、快速的体内、外试验方法，用来评价化学毒物的发育毒性和（或）探讨其作用机制，迄今还没有满意的方法，因为发育毒性涉及亲代两性，从配子到下一代出生的多个发育阶段，不能只用一、二种方法去回答这么复杂的毒性问题。这些替代试验的验证仍然是主要的和迄今无法解决的问题，缺乏公认的标准，来自试验的敏感性的意义和对结果的特异性的评价都有疑问。已知的胚胎形成的复杂性和潜在的发育毒性机制和靶位置的多样性，期望有一个单一的，或者甚至大体上用一小套对活性化学物精确地预筛的试验也许都是不切实际的。
　　这类试验主要是哺乳动物或非哺乳动物的体内、外细胞、组织、器官培养。近年进行过较广泛的确认研究的主要有三个体外的胚胎毒性实验、大鼠全胚胎培养试验，大鼠胚胎肢芽微团实验和小鼠胚胎干细胞试验。这些试验不论是作为相应的筛选试验还是用于解释发生机制的研究，均可与整体动物试验相结合，提供有价值的资料并间接减少所用动物的数量。然而，由于缺少与发育过程一致的复杂性和母代与发育个体之间互动的动力学机制，这些试验并不能肯定某种效应的存在，对危险／暴露评价的意义不大，不能替代整体动物生殖毒性检测试验，不属于产品登记必须资料之列。
　　1．大鼠全胚胎培养
　　大鼠全胚胎培养（whole embryo culture，WEC）是从孕期第9—10天大鼠子宫取出胚胎，剥去Reichert膜，放入培养液中加入受试物，在含02、C02、N2环境中，旋转培养。观察胚胎发育情况，记录胚胎存活，检测胚芽、卵黄囊直径、体节和体长等。以胚胎的心跳和血液循环是否存在作为胚胎存活的指标；以卵黄囊直径、颅臀长和头长、体节数和胚胎重作为胚胎生长发育的指标；根据Brown评分对器官形态分化作出评价。可以筛试化学物的发育毒性、探讨其剂量反应关系和作用机制。
　　2．胚胎细胞微团培养
　　胚胎细胞微团培养（micromass culture）是从第11天的大鼠胚胎取得代表CNS的原代中脑细胞微团、肢芽区或其他区的细胞微团，在培养瓶中分别加入不同浓度的受试物共同培养5天；用中性红染色判断细胞存活；用ALcian蓝染色判断肢芽软骨细胞分化数量；苏木素染色判断CNS细胞分化数量。对结果进行处理，求出影响终点的IC50。比较受试物组与对照组数据，评价化学毒物的细胞毒性和发育毒性。
　　3．小鼠胚胎干细胞试验
　　小鼠胚胎干细胞试验（the mouse embryonic stem cell test，EST）是将小鼠胚泡内细胞团衍生的胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）在特定条件下，可定向分化为机体多种细胞，因此可作为生物测试系统，用于哺乳动物细胞分化、组织形成过程的发育毒性研究。
　　其中，采用体外长期培养的细胞系进行的试验中，目前较成熟的ES细胞是小鼠ES细胞株D3，它可分化成各种类型的细胞，包括:心肌细胞、内皮细胞、胰岛细胞、神经细胞等。其优点是:①利用建立的细胞株作为研究对象，而不用副杀怀孕动物；②胚胎干细胞具有定向分化为多种细胞的潜能，对模拟早期胚胎发育具有很强的代表性。其中一个实例是ES细胞分化成心肌细胞的EST。该试验同时采用D3和小鼠已分化的成纤维细胞株313。其中D3用于评价染毒后分化成为心肌细胞的能力;D3和3T3用于比较分析细胞的存活能力。
　　4．发育毒性的体内预筛试验（C .K.试验）
　　1982年由Chernoff和Kavlock改进的用于预筛发育毒性的体内试验得到了较体外试验更大的接受度。其原理是：大多数出生前受到的损害将在出生后表现为存活力（存活率）下降和（或）生长迟缓。因此对妊娠动物在主要的器官形成期以接近母亲毒性的有限数量的剂量水平染毒，待自然分娩后，通过观察出生后3天内的新生仔外观畸形、胚胎致死、生长迟缓等发育毒性表现，对新生子代进行外部畸形、生长和生存能力的评估。而不进行传统常规试验中内脏和骨骼的检查，就可达到筛试的目的。它已被证明对很多的化学物是可靠的，美国EPA在“可疑发育毒物危险度评价指南”（1985）中指出，在该试验中造成胎仔死亡的毒物应优先考虑进行深入的发育毒性试验，影响胎仔生长的毒物次之，该试验结果阴性而且试验设计合理者，原则上不作进一步的测试。,,,0.0.0.0 29952,198,"概述
　　一、哺乳动物的生育繁殖过程
　　生殖（reproduction）发育事哺乳动物繁衍种族的生理过程，其中包含生殖细胞发生，即精子发生（spermatogenesis）和卵细胞发生（oogenesis）配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精（fertilization）受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入（implantation）或着床（imbad）胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或称器官形成）胎仔发育、分娩和哺乳过程。生殖发育也可称繁殖过程。
　　二、外源化学物对生殖发育的影响：
　　外源化学物或其他环境因素与机体接触后，可以干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。另外，哺乳动物的性激素岁生殖发育过程也具有调节作用，正常的生殖发育必须在激素调节作用下完成。所以外源化学物，一方面直接作用于生殖发育过程，同时又可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。例如，男性的睾丸萎缩和各种形式的性机能减退，女性可出现痛经、月经紊乱，甚至闭经。卵细胞的受精过程也可受到某些外源化学物的干扰，出现不孕症。此外，神经系统对内分泌功能也有调节作用，因而也可间接影响性腺功能以及生殖发育过程，即通过下丘脑-垂体-睾丸轴或下丘脑-垂体-卵巢轴两条途径作用于生殖发育过程。
　　有些外源化学物与机体接触后，还可以引起各种类型的形态和结构的异常。例如，正在发育中的精细胞可以出现形态畸形或数目变化，而畸形的精子往往也具有功能缺陷。卵细胞受到外源化学物的损害作用后，可以出现死亡或影响其正常受精过程，有时即使能受精，也可能出现胚胎死亡，有些胚胎即使能存活，其正常发育也受到干扰，以致胎仔（儿）出现外观或功能异常。外观的异常通常称为畸形（malformation）。它是外源化学物干扰正常生育繁殖过程的一种表现，称为致畸作用（teratogenic）。
　　三、外源化学物对生殖发育的影响以及损害作用的特点：
　　第一、生殖发育过程较机体其他系统更为敏感。
　　一定剂量的外源化学物对机体其他系统或功能尚未造成损害作用，但生殖过程的某些环节可能已经出现障碍。例如，动物引水中混入1％二甘醇后，动物受孕率、每窝出生幼子数和幼子体重方面都可观察到损害作用，但未出现其他任何一般毒性症状。表明生殖发育过程更较敏感。
　　第二、外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远。
　　一般毒性作用仅表现杂直接接触某种外源化学物的个体并造成损害，而外源化学物对生殖发育过程的损害，不仅直接涉及雌雄两个个体，同时还可以在其第二代个体表现出损害作用，而且此种损害甚至在第二代以后的个体中表现出来。
　　近年来，随着毒理学和生命科学的深入发展，外源化学物对生殖发育损害的研究可分为对生殖过程的影响即生殖毒性，及对发育过程的影响即发育毒性两个方面。由此逐渐发展为生殖毒理学和发育毒理学。
　　生殖毒理学（reproductive toxicology）主要研究外源化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用及其评定，评定方法即为生殖毒性试验。
　　发育毒理学（developmental toxicology）主要研究外源化学物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验，其中主要为致畸试验。
　　生殖毒性及其评定
　　生殖毒理学（reproductive toxicology）是生殖医学与毒理学结合而形成的一门重要交叉学科。主要研究环境因素对生殖系统损害作用的原因、机制和后果。这些损害作用包括对生殖器官、相关的内分泌系统或妊娠结局的改变，表现为对性成熟、配子生成和转运、正常的生殖周期、性行为、生育力、妊娠、分娩和哺乳等的不良影响或依赖于生殖系统完整性的其他功能的改变。
　　一、历史
　　伴随着20世纪工业复兴，估计有5万—6万种化学物在日常生活中使用，每年约有600多种新的化学物投入市场。迄今在美国《化学文摘》中登记的化学物质已逾2000万种。大量资料表明，许多生殖内分泌系统疾病与工业化学物有关。1950年美国霍普金斯大学医院发现，怀孕期间服用黄体酮，先后有600多名女婴出现生殖器男性化畸形；1956年用于治疗妊娠反应的反应停，1961年后出现近万例短肢畸形儿（海豹畸形）；1966～1969年美国波士顿市妇产医院发现，怀孕期间服用己烯雌酚（DES）可使其子代少女患阴道透明细胞腺癌；其他研究还发现，怀孕期间服用DES，其子代男性可发生生殖器先天畸形。1968和1978年在日本，1979年在台湾曾先后发生因多氯联苯（PCBs）污染米糠油而导致的中毒事件，中毒孕妇发生死产、早产和畸胎等。1961～1970年间，美国在侵越战争中多次使用超过允许用量13倍剂量的2，4，5-T和2，4-D脱叶剂，造成2，3，7，8。四氯二苯—p，二恶英（TCDD）的严重污染，导致妇女流产、死胎、畸胎的发生率明显增加。1976年意大利化工厂爆炸，二恶英（dioxins）污染造成3．7万人受害。1999年震惊世界的二恶英公害事件发生在比利时，鸡肉、牛奶被TCDD污染，同年夏天可口可乐在比利时的分厂生产的饮料塑料瓶又受到TCDD污染。我国建国数十年在长江流域血吸虫病流行区使用五氯酚钠灭螺，其杂质中的TCDD所造成的大面积污染及其与人群生殖危害的关系至今仍不清楚。总之，过去半个世纪震惊全球的系列中毒或灾难事件的发生，在世界范围内提高了人们对用药的安全意识，高度关注新的化学物对生殖内分泌系统或妊娠结局的不良影响，促进了与生殖内分泌系统安全相关法律的产生和研究方法指南的问世。此外，对于工作场所职业性生殖危害的了解亦已引起人们对制定企业相关政策和法规的关注。1985年美国医学会（AMA）提出了100多种具有潜在生殖危害的化学物。
　　二、生殖毒性
　　外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为性淡漠，性无能或各种形式的性功能减退。雌性可出现排卵规律改变，月经失调或失经，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎缩或坏死，精子数目减少。
　　三、生殖毒性的评价
　　外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。过去也称为繁殖试验。生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响。评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）妊娠过程情况（正常妊娠率）子代动物分娩出生情况（出生存活率）授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等，是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验。
　　（一）试验方法原则：
　　1．受试动物：
　　性成熟大鼠、小鼠或家兔
　　2．剂量分组：
　　一般设立三个剂量组（至少两个剂量组）和一个对照组，最高剂量组能使亲代动物出现轻度中毒，但不出现死亡或死亡率不超过10％，也不能完全丧失生育能力。进食量显著减少，体重明显下降是轻度中毒的较好观察指标。低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。另设中间剂量组应仅出现较为轻微中毒症状，中间剂量与高剂量，低剂量应呈等比级数。希望最高剂量组出现轻度中毒的目的是表明在已能引起中毒剂量下，如仍不致影响正常生殖过程，则表示该化合物确实不具有生殖毒性，反之，如剂量过低，则难以确定受试物是否不具有生殖毒性，有可能因剂量不足，未达到最小有作用剂量。
　　一般情况下，最高剂量组可略高于在慢性毒性试验中最大无作用剂量，或为LD50的1/10左右。最低剂量可相当于最高剂量的1/30,最好先用少数动物进行预试验。试验开始后每周应根据动物体重调整一次剂量，应始终保持动物应摄入的剂量。
　　3．染毒途径：
　　动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径，一般可混入饲料或饮水中，由动物摄取，也可采用灌胃或胶囊法。
　　4．动物数：
　　利用大鼠或小鼠进行试验时，每组雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只。
　　（二）试验方案
　　传统采用三代两窝生殖实验，即动物繁殖三代，每代生殖两窝，其目的是通过三代生殖过程，可以观察外源化学物对遗传过程的影响。但近年来随着遗传毒理学和致突变试验的不断深入发展，在致突变试验中有许多更为敏感的试验方法，可以更好的检出可能存在的遗传毒性作用，已无必要进行三代生殖试验。而且多年经验证明，在稳定合理的交配和饲养条件下，每代第一窝与第二窝试验结果之间，并无明显的差别，很少通过进行第二窝生殖而发现新的问题。因而主张每代只繁殖一窝，即两代一窝或一代一窝生殖试验法，可以节省人力物力，并缩短试验时间，但也应考虑到受试物的不同，而有区别的对待。一般认为凡不是长期连续与机体接触或代谢率减期较短的受试物可进行一代，例如一般药物；反之，如机体有可能连续长期接触，代谢率减期较长的外源化学物，如食品添加剂和与水或空气有关的环境污染物，则应进行两代生殖试验法。
　　1．三代两窝生殖实验
　　大鼠断奶或出生8周后，开始喂以受试物或以其他方式与受试物接触，共进行8到12周，即直到性发育成熟，相当出生4个月左右。每两周称体重一次，记录进食量并观察有无中毒症状或死亡。将雌雄亲代动物（F0）同笼交配，直至受孕或进行3周为止，雌雄比例1:1或2:1。雌鼠受孕后，即单笼饲养，继续接触受试物。
　　确定是否受孕的方法是每日清晨进行雌性动物的阴道涂片，检查有无精子，亦可检查阴道有无阴栓出现，以确定受精日期。阴栓是雄鼠前列腺的分泌物精液和雌鼠阴道分泌物凝固而成，乳白色蜡块状。交配后可在阴道口外出现。凡发现阴栓或检出精子，即作为受孕第“0”天（也有作为第一天的）。
　　亲代动物（F0）所生仔鼠为第一代（F1）。出生后应检查每窝幼子数，死亡数以及肉眼可见幼子畸形。出生后第4天和第21天逐个称取重量，仔鼠断奶后，母鼠休息10天，再与雄鼠交配一次，每代共交配两次，共有仔鼠两窝。分别称为F1a和F1b，其余第二代和第三代同法进行。故共有F1a、F1b、F2a、F2b、F3a、F3b，所以称为三代两窝
　　在交配期间（约三周），亲代鼠一律喂以含受试物饲料，雌鼠受孕后，即分笼饲养，仍继续给予受试物，各代雄鼠在第二次交配后，即另行处理，不再继续喂养，妊娠期和哺乳期中，雌鼠继续给予受试物。
　　每代第一窝仔鼠（F1a、F2a、F3a）断奶后喂养观察三个月，喂饲不含受试物的普通饲料，观察其生长发育情况。